氧化苦参碱下调ZNF580以抑制LTC-14细胞分泌细胞外基质的分子机制研究

陈凯，张青，刘百庆，陈伟，周芳，张兰，夏时海，许威

胰腺纤维化（pancreatic fibrosis，PF）是胰腺组织逐渐被纤维成分所取代，导致进行性胰腺内外分泌功能不全［1］。PF的发生、发展是慢性胰腺炎（chronic pancreatic，CP）和胰腺癌（pancreatic cancer，PC）的主要病理特征。作为PF 的中心环节，胰腺星状细胞（pancreatic stellate cells，PSC）的活化越来越受到重视。激活的PSC可以产生包括Ⅰ型胶原在内的大量细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分［2］，从而促进PF 的进展。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）作为重要的致纤维化细胞因子在PSC的持续激活中扮演着重要角色，其经典下游通路Smads 通路的激活是其发挥作用的主要途径［3］。研究表明，Smad2和锌指转录因子580（zinc finger transcription factor 580，ZNF580）相互结合，共同作用于TGF-β1 信号通路［4］。ZNF580作为一种锌指蛋白基因，在多种生物学功能中发挥作用。ZNF580 的激活及蛋白的表达会导致下游的基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）表达变化，而MMP-2 可促进细胞外基质的降解，减轻组织纤维化［5］。然而，ZNF580 在胰腺纤维化中的作用还有待于研究。

氧化苦参碱（oxymatrine，OM）是从中药苦参中提取的一种中药单体，其抗氧化［6］、抗纤维化［7］作用已被证实。笔者前期研究证实，OM 可以抑制胰腺星状细胞激活，减轻胰腺纤维化［8］，但其分子靶点尚不明确，具体机制尚未完全阐明。因此，本实验旨在探究ZNF580 在OM 抗胰腺纤维化过程中的作用及其分子机制，为OM 的临床转化应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 胰腺星状细胞LTC-14 细胞株由德国Rostock 大学医院的Robert Jaster 教 授惠赠［9］。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）及IMDM细胞培养基、胰酶消化液购自美国Gibco 公司；青链霉素混合液购自北京索莱宝公司；ShRNA-ZNF580 质粒购自上海吉玛基因有限公司；XtremeGENE HP 转染试剂购自美国罗氏公司；Trizol 购自美国Thermo Fisher公司；Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN、TNF-α和IL-1β酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自南京建成生物有限公司；逆转录及实时定量PCR 试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；ZNF580 抗体购自美国Abcam 公司；MMP-2、Smad2、Smad3、GAPDH 抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；基质金属蛋白酶组织抑制剂1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1）抗体、ECL 发光液购自沈阳万类生物科技有限公司；PVDF 膜购自美国BD 公司；OM、DMSO购自美国Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京碧云天生物技术有限公司；引物购自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 LTC-14 细胞使用10%FBS 的IMDM 培养基于37 ℃、5%CO2的孵育箱（相对湿度为95%）中培养。将处于对数生长期的细胞按干预方式的不同接种于6孔板中，达到70%～80%接触密度时进行处理，每组3 个平行孔。对照组：正常培养的LTC-14 细胞；TGF-β1 组：LTC-14 细胞中加入10µg/L TGF-β1刺激12 h；TGF-β1+OM组：1 g/L OM 预处理LTC-14细胞30 min，然后加入10µg/L TGF-β1刺激12 h；TGF-β1+SiZNF850 组：LTC-14 细胞中瞬时转染ShRNAZNF580 质粒，24 h 后加入10µg/L TGF-β1 刺激12 h。各组培养完后分别收集培养基和细胞。

1.2.2 ZNF580 基因表达抑制 取对数生长期LTC-14 细胞经消化、离心、重悬，进行细胞计数。将含有约5×105个细胞的细胞悬液接种到6孔板中，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞密度达70%～80%时弃培养基，更换无血清IMDM 培养基继续培养4 h 后按照说明书转染ShRNAZNF580质粒，使ZNF580基因低表达。

1.2.3 Real-time PCR 检测细胞基因表达 将各组收集的细胞经PBS清洗后每孔直接加入1 mL Trizol，提取总RNA，一步法逆转录获得cDNA 后使用SYBR Green 染料法进行Realtime PCR，按说明书步骤检测ZNF580、Smad2、Smad3、MMP-2、TIMP1 基因表达，根据qPCR 得出的荧光曲线的Ct 值，以β-actin 为内参，用2-ΔΔCt计结果，ΔCt=目的基因Ct 值－内参Ct 值，ΔΔCt=实验组ΔCt 值－对照组ΔCt 值。实验结果以对照组的倍数表示。引物设计经由PubMed 下引物合成程序Primer-BLAST设计，见表1。

Tab.1 Sequence of each gene primer表1 各基因引物序列

1.2.4 Western blot 检测细胞内蛋白表达 将各组收集的细胞用PBS 清洗后，加入100µL 蛋白裂解液，经细胞破碎仪超声后，置于冰上30 min，充分裂解，13 000 r/min 离心20 min，提取总蛋白，BCA 蛋白定量后变性。按每孔30µg 蛋白浓度上样，90～120 V 电泳1.5 h，90 V 转膜1 h，5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗ZNF580（1∶1 000）、Smad2（1∶1 000）、Smad3（1∶1 000）、MMP-2（1∶500）、TIMP1（1∶200）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，辣根过氧化物酶标记二抗室温摇床孵育2 h，ECL化学发光，Image J 软件进行灰度分析，所得结果用GraphPad Prism 6.0软件进行分析。

1.2.5 ELISA法检测细胞外基质中Col-I、Col-III、FN、TNF-α和IL-1β 的分泌水平 取细胞上清液，预先封闭酶标板，确定稀释浓度，按1孔阴性对照，8孔标准品（2倍稀释），各组3复孔待测样品上样，按说明书依次加入酶标抗体、底物液、终止液37 ℃孵育，并在每一个步骤后洗板，酶标仪测定各组样品450 nm处的吸光度值，与标准曲线比对换算为浓度。

1.3 统计学方法 使用GraphPad Prism 6.0软件分析处理数据。符合正态分布的计量数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OM 和ZNF580 基因沉默对MMP-2/TIMP1 比值的影响 与对照相比，TGF-β1 组MMP-2/TIMP1 比值在mRNA 和蛋白水平上均降低（P＜0.05）；而TGF-β1+OM 组和TGF-β1+SiZNF580 组中MMP-2/TIMP1 比值均显著高于TGF-β1 组（P＜0.05），见图1、表2。

Fig.1 The influence of OM and SiZNF580 on the expression of MMP-2/TIMP1 in LTC-14 cells induced by TGF-β1图1 OM和ZNF580基因沉默对TGF-β1诱导的LTC-14细胞中MMP-2/TIMP1比值的影响

Tab.2 The effect of OM and SiZNF580 on the expression of MMP-2/TIMP1 in LTC-14 cells induced by TGF-β1表2 OM和SiZNF580对TGF-β1诱导的LTC-14细胞中MMP-2/TIMP1表达的影响 （n=3，±s）

Tab.2 The effect of OM and SiZNF580 on the expression of MMP-2/TIMP1 in LTC-14 cells induced by TGF-β1表2 OM和SiZNF580对TGF-β1诱导的LTC-14细胞中MMP-2/TIMP1表达的影响 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a 与对照组比较，b 与TGF-β1 组比较，P＜0.05；表3～6同

组别对照组TGF-β1组TGF-β1+OM组TGF-β1+SiZNF850组F MMP-2/TIMP1 mRNA水平1.37±0.54 0.39±0.04a 3.15±0.37b 3.29±0.82b 21.629＊＊MMP-2/TIMP1蛋白水平3.10±1.22 1.43±0.30a 6.98±1.80b 5.96±1.05b 13.219＊＊

2.2 OM 和ZNF580 基因沉默对ECM 分泌水平的影响 与对照组相比，TGF-β1组中Col-I、Col-III、FN、TNF-α和IL-1β水平均升高（P＜0.05）；而TGF-β1+OM 组和TGF-β1+SiZNF580 组中上述ECM 各指标分泌水平均显著低于TGF-β1组（P＜0.05），见表3。

2.3 OM和ZNF580基因沉默对TGF-β1/Smads信号通路的影响 与对照组相比，TGF-β1 组中Smad2、Smad3 的mRNA 和蛋白表达水平均升高（P＜0.05），而TGF-β1+OM 组 和TGF-β1+SiZNF580 组 中Smad2、Smad3 的mRNA 和蛋白表达水平较TGF-β1组均下降（P＜0.05），见图2、表4。

2.4 OM和ZNF580基因沉默对LTC-14细胞活化的影响 和对照组相比，TGF-β1 组中α-SMA 的mRNA 和蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05），而TGF-β1+OM 组和TGF-β1+SiZNF580 组中α-SMA的mRNA 和蛋白表达水平较TGF-β1组均显著下降（P＜0.05），见图3、表5。

Tab.3 The effect of OM and SiZNF580 on the secretion level of ECM in LTC-14 cells induced by TGF-β1表3 OM和SiZNF580对TGF-β1诱导的LTC-14细胞中ECM分泌水平的影响 （n=3，ng/L，±s）

Tab.3 The effect of OM and SiZNF580 on the secretion level of ECM in LTC-14 cells induced by TGF-β1表3 OM和SiZNF580对TGF-β1诱导的LTC-14细胞中ECM分泌水平的影响 （n=3，ng/L，±s）

组别对照组TGF-β1组TGF-β1+OM组TGF-β1+SiZNF580组F Col-Ⅰ6.20±0.55 14.13±1.33a 8.14±0.71b 7.14±0.14b 58.934＊＊Col-Ⅲ5.07±1.15 16.65±2.42a 7.02±1.13b 5.95±0.43b 40.125＊＊FN 23.53±2.63 50.88±4.77a 29.82±1.33b 26.91±1.85b 52.358＊＊TNF-α 7.82±0.72 18.97±1.79a 10.90±0.50b 9.67±0.91b 60.547＊＊IL-1β 4.54±1.02 12.44±2.61a 7.03±0.55b 5.11±0.76b 17.839＊＊

Fig.2 The influence of OM and SiZNF580 on the expressions of Smad2 and Smad3 in LTC-14 cells induced by TGF-β1图2 OM和ZNF580基因沉默对TGF-β1诱导的LTC-14细胞中Smad2、Smad3基因表达的影响

Tab.4 The effect of OM and SiZNF580 on the expressions of Smad2 and Smad3 in LTC-14 cells induced by TGF-β1表4 OM和SiZNF580对TGF-β1诱导的LTC-14细胞中Smad2、Smad3表达水平的影响（n=3，±s）

Tab.4 The effect of OM and SiZNF580 on the expressions of Smad2 and Smad3 in LTC-14 cells induced by TGF-β1表4 OM和SiZNF580对TGF-β1诱导的LTC-14细胞中Smad2、Smad3表达水平的影响（n=3，±s）

组别对照组TGF-β1组TGF-β1+OM组TGF-β1+SiZNF580组F mRNA水平Smad2 1.10±0.15 2.07±0.25a 1.09±0.11b 1.04±0.07b 28.206＊＊Smad3 1.02±0.05 3.85±1.06a 1.42±0.41b 1.04±0.06b 17.140＊＊蛋白水平Smad2 0.55±0.08 1.04±0.17a 0.60±0.03b 0.58±0.06b 16.736＊＊Smad3 0.48±0.18 1.68±0.34a 0.49±0.12b 0.45±0.06b 26.417＊＊

2.5 OM 下 调LTC-14 细 胞 中TGF-β1 诱 导 的ZNF580 基因的表达 TGF-β1 组ZNF580 mRNA 和蛋白水平较对照组显著升高（P＜0.05），而TGF-β1+OM 组和TGF-β1+SiZNF580 组中ZNF580 表达较TGF-β1组均显著降低（P＜0.05），见图4、表6。

3 讨论

Fig.3 The influence of OM and SiZNF580 on the expression of α-SMA in LTC-14 cells induced by TGF-β1图3 OM和ZNF580基因沉默对TGF-β1诱导的LTC-14细胞中α-SMA表达的影响

Tab.5 The effect of OM and SiZNF580 on the expression of α-SMA in LTC-14 cells induced by TGF-β1表5 OM和SiZNF580对TGF-β1诱导的LTC-14细胞中α-SMA表达水平的影响 （n=3，±s）

Tab.5 The effect of OM and SiZNF580 on the expression of α-SMA in LTC-14 cells induced by TGF-β1表5 OM和SiZNF580对TGF-β1诱导的LTC-14细胞中α-SMA表达水平的影响 （n=3，±s）

组别对照组TGF-β1组TGF-β1+OM组TGF-β1+SiZNF850组F α-SMA mRNA水平1.04±0.04 3.81±0.26a 1.19±0.14b 0.99±0.06b 244.252＊＊α-SMA蛋白水平0.58±0.05 1.82±0.15a 0.69±0.07b 0.52±0.09b 122.804＊＊

Fig.4 OM represses the expression of ZNF580 in LTC-14 cells induced by TGF-β1图4 OM下调LTC-14细胞中TGF-β1诱导的ZNF580基因的表达

胰腺纤维化是慢性胰腺炎和胰腺癌的共同病理特征，是胰腺功能丧失［10］和胰腺癌细胞对放化疗药物不敏感［11］的主要原因。由于胰腺纤维化的分子机制尚未阐明，迄今为止，临床上仍缺乏对慢性胰腺炎和胰腺癌有效的药物或治疗方式［1］，因此研究胰腺纤维化发生发展的分子机制显得尤为重要。

PSC 在胰腺纤维化中的作用越来越受到重视［12］。在正常情况下，PSC处于静止状态，其代谢和功能不活跃，无促纤维化作用；当胰腺组织受损或炎症因子等因素刺激时，PSC活化，细胞代谢及增殖活跃，COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、LN、FN 等ECM 分泌增多，且MMP-2/TIMP1比值下降，致使ECM分泌增多而降解减少，最终形成胰腺纤维化［13］。PSC 在胰腺纤维化的发生、发展中起到核心作用［14］。近年来，PSC的生物学功能研究主要集中在生物学特性与ECM 的相互作用等方面。研究发现，PSC 与ECM 之间相互影响，阻断它们之间的相互作用可能是抑制进行性胰腺纤维化的有效措施［15］。

Tab.6 The effect of OM and SiZNF580 on the expression of MMP2/TIMP1 in LTC-14 cells induced by TGF-β1表6 OM对TGF-β1诱导的LTC-14细胞中ZNF580表达的影响 （n=3，±s）

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TGF-β1是诱导PSC激活的主要细胞因子，在胰腺纤维化的发生发展中发挥关键作用，其主要通过TGF-β1/Smads 通路激活PSC［16］，下调MMPs/TIMPs比值，促进ECM 分泌，诱导胰腺纤维化［17］。本研究也发现，TGF-β1 可上调LTC-14 细胞中Smad2、Smad3 和α-SMA 的mRNA 和蛋白表达水平，且下调MMP2/TIMP1的比值，致使细胞分泌的Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN、TNF-α 和IL-1β 水平升高，表明TGF-β1 通过Smads 通路激活LTC-14 细胞，从而使LTC-14 细胞ECM分泌水平升高。

大量研究发现，OM 可通过TGF-β1 减轻肝［18］、肾［19］、心肌［20］等器官的纤维化。笔者前期研究表明，OM 可以抑制LTC-14 细胞中TGF-β1/Smads 通路的激活［21］，下调α-SMA 的表达［8］。本研究也发现，OM 可以抑制LTC-14 细胞中TGF-β1 对Smad2、Smad3和α-SMA 的上调作用。而进一步研究显示，OM 可抑制LTC-14 细胞中TGF-β1 对MMPs/TIMPs比值的下调，进而抑制Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN、TNF-α和IL-1β 的分泌，表明OM 通过阻抑TGF-β1/Smads信号通路抑制LTC-14 细胞激活，减少ECM 分泌。因此，Smads 蛋白在OM 抗TGF-β1 所致的胰腺纤维化中发挥重要作用，研究Smad信号通路下游的关键分子将有助于阐明胰腺纤维化发生的分子机制以及OM的作用机制。

Luo 等［4，22］运用免疫共沉淀技术和共聚焦显微镜发现，Smad2 和ZNF580 相互结合，共同作用于TGF-β1信号通路，且TGF-β1下调血管内皮细胞中ZNF580 的表达水平。而本研究发现，TGF-β1 可上调LTC-14 细胞中ZNF580 的mRNA 和蛋白表达水平。TGF-β1对ZNF580基因截然相反的调节作用，可能与细胞种类有关，ZNF580在不同细胞中发挥作用可能不同，但其深入机制还有待于研究。值得注意的是，ZNF580 基因沉默后，TGF-β1 对LTC-14 细胞中Smad2、Smad3 和α-SMA 基因的上调作用也被阻滞，且TGF-β1对MMP2/TIMP1比值的下调作用被抑制，PSC 分泌的Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN、TNF-α 和IL-1β 水平也下调。这些结果表明，ZNF580 基因沉默可抑制Smads通路的活化，进而抑制LTC-14细胞激活，减少ECM 分泌，提示ZNF580 和Smads 通路之间可能存在调控机制。另外，本研究显示OM 可以抑制LTC-14细胞中TGF-β1对ZNF580基因的上调作用。结合上述结果，笔者推测OM可能通过TGF-β1/Smads/ZNF580通路抑制PSC的活化，进而减少ECM的分泌，减轻胰腺星状细胞纤维化。

综上所述，OM 可能通过抑制TGF-β1/Smads 信号通路来下调转录因子ZNF580 的表达，抑制LTC-14 的活化，阻滞LTC-14 细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN等ECM 的分泌，并上调MMP-2/TIMP1 比值，减轻胰腺纤维化。ZNF580 可能是OM 的作用靶点，在胰腺纤维化中发挥重要作用，但具体的分子机制仍需深入研究。