苯乙双胍通过影响线粒体功能促进A549/DDP细胞凋亡

侯永旺，常娇，王艳辉，任丽

肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤［1］。早期肺癌多行手术联合化疗的方案，但对于晚期肺癌患者，化疗是其主要的治疗方式。化疗的药物种类繁多，但以铂类为主的化疗方案最为主要。然而，有部分肺癌患者对于铂类药物的治疗反应性很差，即出现顺铂耐药现象，尤其是非小细胞肺癌。苯乙双胍是通常用于治疗2型糖尿病的一种双胍类药物［2］，因其在治疗2型糖尿病过程中出现的不良反应，所以在部分国家限制了该药的使用［3］。然而有研究表明，苯乙双胍具有抗肿瘤活性［4］，并且与2-脱氧葡萄糖（2-DG）联合使用可以降低乳酸中毒的发生率［5］。另外，苯乙双胍可以干扰肝癌细胞的线粒体的氧化磷酸化功能，从而达到抑制肿瘤的作用［6］。但是苯乙双胍抗肿瘤的作用机制尚不明确，本研究旨在探讨苯乙双胍对肺癌细胞的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP 和A549 细胞源自于天津医科大学免疫微环境与疾病省部共建教育部重点实验室。主要试剂：DCFH-DA 活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂、Mitotracker Red 线粒体示踪剂和Rhod-2 钙离子检测试剂均购自美国Invitrogen 公司，异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）Annexin V 凋亡试剂盒购自美国BD 公司，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）检测试剂盒购自中国碧云天试剂公司，总DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，RPMI-1640培养基购自美国Gibco 公司，抗氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）抗体混合物购自美国Abcam公司。磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）购自美国BI公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A549/DDP 细胞和A549 细胞分别培养于含10%小牛血清的1640的培基中，放于5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养，隔天换液1 次，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞活力测定 将对数生长期的A549 细胞和A549/DDP细胞分别接种于96孔板，每孔5 000个细胞，贴壁24 h后分别加入50µmol/L 顺铂和2.5 mmol/L 苯乙双胍处理，每组设置5 个复孔，分别检测0、24、48 h 的细胞活力。每孔加入20µL MTS，37 ℃反应1 h，酶标仪检测490 nm 处光密度（OD）值，计算细胞增殖率R1（%）=OD（终时点）/OD（0h）×100%，实验重复3次。

1.2.3 增殖实验及克隆形成实验 取对数生长期的A549/DDP细胞，实验分为2组，苯乙双胍组以2.5 mmol/L苯乙双胍处理，对照组采用PBS 处理。（1）细胞增殖实验：将对数生长期的A549/DDP细胞接种于96孔板，每孔5 000个细胞，每组设置5 个复孔，贴壁24 h 后，开始对A549/DDP 细胞分组处理，之后每孔加入20µL MTS，37 ℃反应1 h，在490 nm 处分别检测2组不同处理的细胞第0 h、24 h、48 h的OD值。计算细胞增殖率R2（%）=OD（终时点）/OD（0h）×100%，实验重复3 次。（2）克隆形成实验：将对数生长期的A549/DDP 细胞，调整密度为10 000个/mL，按照312个/孔细胞梯度接种于6孔板，贴壁24 h 后，对A549/DDP 细胞分组处理，实验组每隔2 d 换上含有苯乙双胍的新鲜培养基；对照组每隔2 d 换上新鲜培养基，待克隆形成后结晶紫染色，统计2组集落形成的个数，实验重复3次。

1.2.4 凋亡实验 分组及处理同1.2.3，细胞处理24 h 后，用胰蛋白酶将细胞消化，收集于干净的离心管中，PBS 洗3 遍，调整细胞密度为1×106/mL，加入FITC Annexin V 和PI 染料，避光孵育5～10 min后，上流式细胞仪进行检测，统计凋亡率，凋亡率=Q2区数值+Q3区数值，实验重复3次。

1.2.5 胞内ROS、线粒体质量和线粒体钙离子检测 分组及处理同1.2.3，细胞处理24 h后，弃去原培养基，加入无血清的培养基后，分别加入终浓度为10µmol/L DCFH-DA 2 mL 避光反应10 min检测细胞内ROS、100 nmol/L Mitotracker Red 2 mL反应15 min检测线粒体质量、4µmol/L Rhod-2 2 mL染色10 min检测钙离子，染色结束后，消化离心，PBS洗3遍，调整细胞密度为1×106/mL，用滤网将细胞过滤后，上流式细胞仪进行检测，计算每组细胞荧光强度（fluorescence intensity，FI）。

1.2.6 ATP 检测 分组及处理同1.2.3，细胞处理24 h 后，弃去培养基，置于冰上，PBS洗3遍，加入200µL裂解液裂解细胞。按照ATP 检测试剂盒内的实验步骤进行检测，用luminometer 检测RLU 值，实验结果以与对照组的倍数表示，实验重复3次。

1.2.7 mtDNA检测 分组同1.2.3。用总DNA提取试剂盒提取A549/DDP细胞的总DNA，通过实时荧光定量PCR检测2组的mtDNA 表 达 量。 引 物 序 列：Mt -Mito 上 游 5′-CACTTTCCACACAGACATCA-3′， 下 游 5′ - TGGTTA GGCTGGTGTTAGGG - 3′；B2M 上 游 5′- TGTTCCT GCTGGGTAGCTCT-3′，下游5′-CCTCCATGATGCTGCTTACA-3′。PCR反应体系：DNA模板200 ng，2µL；引物混合物1µmol/L，8µL；SYBER Green 10µL。反应条件：预变性95 ℃5 min，1个循环；95 ℃变性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共45个循环；熔解曲线分析：95 ℃10 s，65 ℃60 s，97 ℃1 s，1个循环；冷却：37 ℃30 s，1个循环。根据qPCR得出的荧光曲线的Ct值，以B2M基因为内参，ΔCt=目的基因Ct值-B2M基因Ct值，ΔΔCt=实验组ΔCt值-对照组ΔCt值，用2-ΔΔCt计算结果。实验重复3次。

1.2.8 Western blot 检测线粒体氧化磷酸化蛋白表达 PBS和2.5 mmol/L 苯乙双胍处理A549/DDP 细胞24 h，弃去培养基，PBS 洗3 遍，每孔加入200µL 含蛋白酶抑制剂的RIPA 细胞裂解液，在冰上用细胞刮将细胞刮下，置于冰上30 min，12 000 r/min 离心10 min，取上清，用BCA 蛋白定量试剂盒检测对照组和实验组蛋白浓度。每组上样20µg 蛋白，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，60 V 电压40 min 使蛋白进入分离胶，100 V电压电泳1 h。100 V电压4 ℃湿转80 min将胶上蛋白转至PVDF 膜上，用5%脱脂牛奶封闭PVDF 膜1 h，4 ℃摇床孵育抗OXPHOS（混合抗体，1∶500稀释）过夜。TBST洗膜3次，室温孵育二抗（1∶10 000稀释）1 h，TBST洗膜3次，使用Immobilon Western 化学发光HRP 底物和Tanon 6200 发光成像仪器检测蛋白的表达水平，以ATP5A 为内参，计算各组蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法 采用GraPh Pad Prism 7.0 和FlowJo 7.6 作图，SPSS 22.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用±s表示，2组比较采用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 顺铂和苯乙双胍对A549/DDP 细胞和A549 细胞增殖率的影响 （1）组间比较。与顺铂组比较，苯乙双胍组A549/DDP 细胞在24 h 和48 h 的细胞增殖率降低（P＜0.05），而2组间A549细胞24 h和48 h增殖率差异无统计学意义。（2）组内不同细胞系间比较。48 h 顺铂处理的A549/DDP 细胞增殖率均高于A549 细胞（P＜0.05），而24 h 间差异无统计学意义；苯乙双胍处理的A549/DDP 细胞增殖率24 h 和48 h均低于A549细胞（P＜0.05），见表1。

2.2 苯乙双胍对A549/DDP 细胞生长的影响 与PBS组相比较，苯乙双胍组A549/DDP细胞的24 h和48 h 增殖率、集落形成数减低，而凋亡率升高（P＜0.05），见表2、图1。

Fig.1 Effects of different treatments on colony number and apoptosis rate of A549/DDP cells图1 不同处理对A549/DDP细胞克隆形成个数和凋亡率的影响

2.3 苯乙双胍对A549/DDP 细胞线粒体功能的影响 与PBS组相比，苯乙双胍组的A549/DDP细胞内ROS 水平增高，Mitotracker、Rhod-2、mtDNA 及ATP水平降低（P＜0.05），见图2、表3。Western blot 结果显示，用苯乙双胍组的A549/DDP细胞线粒体氧化磷酸化复合物Ⅰ中的NDUFB8、复合物Ⅱ中的SDHB和复合物Ⅳ中的MTCO1 蛋白表达量明显降低（P＜0.05），见图3、表4。

3 讨论

顺铂是临床上治疗肺癌的主要化疗药物，但是随着顺铂耐药的出现，使得顺铂的使用和疗效在一定程度上受到了限制。苯乙双胍是治疗糖尿病的双胍类药物，能够促进多种癌细胞死亡，但是苯乙双胍在A549/DDP细胞中的作用机制尚鲜见报道，本研究结果显示，与顺铂组比较，苯乙双胍组A549/DDP 细胞在24 h的细胞活力比降低，而2组间A549细胞24 h活力差异无统计学意义。为了排除因为药物作用时间所导致的不稳定性，本研究检测了2 组药物作用48 h 对两种细胞活力的影响，结果发现与顺铂组比较，苯乙双胍组A549/DDP细胞在48 h的细胞活力比降低，而2组间A549细胞48 h活力差异无统计学意义，用顺铂处理的两种细胞在24 h 细胞活力差异无统计学意义，这也许是因为药物作用时间短所导致。但是在48 h，顺铂处理的A549/DDP细胞活力比A549 细胞活力高；而苯乙双胍处理的A549/DDP 细胞活力低于A549细胞，表明A549/DDP细胞较A549细胞对苯乙双胍更为敏感。

Tab.1 Effects of two drugs on the proliferation rate of different cells表1 2种药物对不同细胞增殖率的影响 （n=3，%，±s）

Tab.1 Effects of two drugs on the proliferation rate of different cells表1 2种药物对不同细胞增殖率的影响 （n=3，%，±s）

＊P＜0.05；t1、t2表示2组内不同细胞系间24 h、48 h比较

组别顺铂组苯乙双胍组t A549/DDP细胞24 h48 h24 h48 h 83.113±7.59765.683±10.24065.516±12.39644.386±30.363±5.03317.877±5.29248.550±5.03333.790±10.026＊7.184＊2.1961.90 A549细胞8.139 5.132 7 t1 t2 2.096 4.425＊2.820＊3.739＊

Tab.2 Effects of phenformin on proliferation rate,colony number and apoptosis rate of A549/DDP cells表2 苯乙双胍对A549/DDP细胞的增殖率、集落形成数、凋亡率的影响 （n=3，±s）

Tab.2 Effects of phenformin on proliferation rate,colony number and apoptosis rate of A549/DDP cells表2 苯乙双胍对A549/DDP细胞的增殖率、集落形成数、凋亡率的影响 （n=3，±s）

＊P＜0.05

组别PBS组苯乙双胍组t增殖率（%）24 h 267.840±42.246 33.949±8.430 9.404＊48 h 512.438±44.416 19.210±7.024 18.998＊集落形成数（个/视野）158.000±37.041 3.333±1.528 7.226＊凋亡率（%）6.987±2.405 33.950±4.727 8.805＊

Fig.2 Effects of phenformin on ROS,Mitotracker and Rhod-2 in A549/DDP cells图2 苯乙双胍对A549/DDP细胞内ROS，Mitotracker和Rhod-2的影响

Tab.3 Effects of phenformin on mitochondrial function of A549/DDP cells表3 苯乙双胍对A549/DDP细胞线粒体功能的影响 （n=3，±s）

Tab.3 Effects of phenformin on mitochondrial function of A549/DDP cells表3 苯乙双胍对A549/DDP细胞线粒体功能的影响 （n=3，±s）

＊P＜0.05；表中ROS，Mitotracker，Rhod-2的数据是荧光强度值（FI），mtDNA和ATP的值是标准化以后的倍数值

组别ROS Mitotracker Rhod-2mtDNA ATP PBS组苯乙双胍组t 2 042 333±354 367 3 103 333±544 548 2.829＊471 000±110 436 251 333±42 063 3.220＊20 133±5 390 5 744±868 4.565＊1.000 0±0.000 0 0.720 4±0.116 3 4.165＊1.000 0±0.000 0 0.558 3±0.077 0 9.934＊

Fig.3 Western blot detection of OXPHOS protein expression in two groups图3 Western blot检测2组OXPHOS蛋白的表达

Tab.4 Relative expression of OXPHOS protein表4 OXPHOS蛋白相对表达量（n=3，±s）

Tab.4 Relative expression of OXPHOS protein表4 OXPHOS蛋白相对表达量（n=3，±s）

＊P＜0.05

组别PBS组苯乙双胍组t MTCO1 1.000 0±0.000 0 0.476 7±0.155 4 5.835＊SDHB 1.000 0±0.000 0 0.263 3±0.070 2 18.166＊NDUFB8 1.000 0±0.000 0 0.356 7±0.102 6 10.857＊

Yanjun等［7］研究发现苯乙双胍能够抑制膀胱癌细胞增殖和克隆形成，促进膀胱癌细胞凋亡，Wang等［8］研究发现，苯乙双胍可以抑制肺癌细胞增殖。本研究结果发现，与PBS 组相比较，苯乙双胍组A549/DDP细胞的24 h和48 h增殖率、集落形成数减低，而凋亡率升高，表明苯乙双胍能够明显抑制A549/DDP 细胞增殖、克隆形成并促进其凋亡，提示苯乙双胍可能是治疗耐顺铂肺癌的潜在药物。研究表明，苯乙双胍在LKB-1缺失肺癌中具有抗肿瘤活性［9］，在细胞代谢应激状态下，LKB-1 是激活AMPK的主要激酶，而AMPK 是一种高度保守的能量传感器和细胞生长和代谢调节剂，苯乙双胍通过LKB-1/AMPK 通路发挥抑制肿瘤细胞增殖作用，可抑制AMPK 磷酸化，降低其对于苯乙双胍的作用［10］。Matsuzaki 等［11］发现苯乙双胍可抑制线粒体氧化磷酸化复合体Ⅰ的活性，从而达到促进细胞凋亡的效果。线粒体是真核细胞重要的细胞器，其在细胞能量代谢、生物合成和细胞死亡的调控中起关键作用，参与了肿瘤细胞活性氧自由基稳态变化、组织浸润和转移能力以及抵抗细胞死亡［12］。线粒体对于清除ROS有重要作用，线粒体功能破坏后膜电位受损，会导致细胞内ROS 聚集，诱导细胞凋亡［13］。本研究结果表明，与PBS 组相比，苯乙双胍组的A549/DDP 细胞内ROS 水平增高，Mitotracker、钙离子水平减低，表明在A549/DDP细胞内线粒体膜电位减低，这可导致ROS堆积。这些结果与Liu等［14］发现的线粒体膜电位受损可导致ROS 增多，从而导致细胞死亡结果相似。因此，笔者推测苯乙双胍促进A549/DDP细胞凋亡可能是通过破坏线粒体膜电位、增加胞内ROS这一机制发挥作用。

癌细胞存活需要大量ATP来满足其自身增殖过程中生物合成所需的能量，而线粒体的主要功能之一就是通过氧化磷酸化产生ATP。Goscinski等［15］研究发现，mtDNA减少、MTCO1表达蛋白降低、ATP水平降低会促进前列腺癌细胞死亡。本研究结果显示，与PBS 组相比，苯乙双胍组的A549/DDP 细胞内mtDNA 及ATP 水平降低，线粒体氧化磷酸化复合物Ⅰ中的NDUFB8、复合物Ⅱ中的SDHB和复合物Ⅳ中的MTCO1 蛋白表达量明显降低，与Goscinski 等［15］和Kang 等［16］结果相似。目前研究普遍认为苯乙双胍可以抑制线粒体氧化磷酸化复合物Ⅰ，而本结果显示苯乙双胍还同时抑制了A549/DDP 细胞线粒体氧化磷酸化复合物Ⅱ和复合物Ⅳ，这也许是细胞系不同导致的差异，还需要进一步研究和验证。因此，苯乙双胍能够减少mtDNA，抑制氧化磷酸化，从而导致ATP 生成减低，这也许是苯乙双胍抑制A549/DDP细胞增殖的另一种可能的机制。