慢性丙型肝炎患儿外周血NK细胞抑制受体的表达及其临床意义

张咏芳 杨俊梅

自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)是人体固有免疫细胞，具有抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节功能[1]。在NK细胞抵抗丙型肝炎病毒时，由于慢性丙型肝炎(CHC)细胞因子的暴露会诱导NK细胞毒性过度表达，导致正常的肝细胞损伤，影响病情的发展[2]。因此，NK细胞抑制受体的表达对CHC的诊断与治疗有重要的意义。本研究通过对我院135例CHC患儿CD158b、CD159e及NKG2D表达水平分析，探讨其与肝纤维化程度相关性。

资料与方法

一、一般资料

选取2015年1月至2018年1月我院收治的CHC患儿135例，其中男性75例，女性60例，平均年龄(5.5±0.7)岁。根据《丙型肝炎防治指南》[3]对丙型肝炎进行诊断。根据患者肝功能是否异常(ALT>40 U/L)将患者分为肝功能正常组(n=97)与肝功能异常组(n=38)，其中正常组97例，异常组38例；根据肝纤维化分期将患者分为S0～4期，其中S0期36例、S1～2期68例、S3～4例31例。纳入标准为：(1)血液中HCV RNA持续存在，大于6个月；(2)年龄低于14岁。排除标准：(1)甲型、乙型、丁型、戊型肝炎；(2)药物性肝炎；(3)酒精性肝炎；(4)肝癌患者。所有患儿及其家属均对本研究知情同意，并签署知情同意书。本研究获得我院医学伦理委员会批准同意。

二、方法

(1)收集患儿性别、年龄、感染途径、病毒基因型、肝硬化及抗病毒治疗情况等资料。

(2)肝功能检测 采集患儿静脉血4 mL，采用AU2700全自动生化分析仪(OLYMPUS)检测丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)。ALT正常值上限为40，肝功能异常(ALT>40 U/L)[4]。

(3)HCV RNA载量测定 采用RT-PCR检测血清HCV RNA病毒载量(合肥莱尔生物)。

(4)CD158b、CD159e及NKG2D检测 在肝活检时采用流式细胞仪检测NK细胞，将NK细胞表面抗原用患者PBMC与抗CD158b( KIR2DL2 / DL3)-藻红素(PE)(人；克隆dx27)，抗CD159e(KIR3DL1)-PE(人；克隆DX9)共同孵育，激活受体。通过同种对照染色确定背景染色水平，用裂解液溶解红细胞和淋巴细胞， NK细胞受体通过流式细胞仪检测。

(5)肝纤维化评定 肝组织活检：在B超引导下行肝穿刺，取组织长度>1.0 cm，10%甲醛浸泡送病理科检验，由本院2名经验丰富的病理科医师采用S分期评估肝纤维化程度，将其分为S0～S4。采用EPIQ7彩色多普勒超声诊断仪(荷兰飞利浦)检查肝表面光滑度和肝实质回声情况，并对其进行评分。若肝表面光滑度和肝实质回声各为3分，综合肝表面光滑度和肝实质回声情况计算肝纤维化程度评分，评分越高代表纤维化程度越严重[5]。

三、统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件处理数据，CD158b、CD159e及NKG2D等资料采用(均数±标准差)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用S-N-K检验；年龄等计数资料用n(%)表示，采用卡方检验；相关性采用Pearson卡方分析；采用受试者工作特征曲线(ROC)分析CD158b、CD159e及NKG2D诊断晚期肝纤维化的效能。检验标准：α=0.05。

结 果

一、 CHB患儿肝功能正常组与肝功能异常组血清CD158b、CD159e及NKG2D水平比较

由表1数据可知，肝功能异常患儿血清CD158b、CD159e及NKG2D水平均明显高于肝功能正常患儿(P<0.05)。

二、 CD158b、CD159e及NKG2D相关性分析

CD158b与CD159e及NKG2D均呈正相关(r=0.195、0.387，P=0.023、0.000)，CD159e与NKG2D呈现正相关(r=0.493，P<0.001)。

表1 肝功能正常组与肝功能异常组外周血NK细胞抑制受体表达水平比较

三、 CD158b、CD159e及NKG2D在不同肝纤维化程度中的表达水平比较

S0、S1～2、S3～4组患者血清CD158b、CD159e及NKG2D比较差异有统计学意义(P<0.05)；其中S0组患者血清CD158b、CD159e及NKG2D均明显低于S1～2组(q=7.735、5.532、4.997，均P<0.05)，S1～2组CD158b、CD159e及NKG2D水平明显低于S3～4组(q=8.372、7.587、5.743，均P<0.05)。

四、 CD158b、CD159e及NKG2D与临床病理的关系

结果提示，CD158b、CD159e及NKG2D在患儿性别、年龄、病毒感染途径、病毒基因型分布上比较差异无统计学意义(P>0.05)；而在肝硬化及未接受抗病毒治疗患儿的血清水平明显升高。

五、 CD158b、CD159e及NKG2D与肝纤维化程度相关性

135例CHC患儿肝纤维化程度评分为(2.7±0.6)分，相关性分析显示，CD158b、CD159e及NKG2D与肝纤维化程度呈正相关(r=0.332、0.465、0.275，均P<0.05)，提示，三者水平均随肝纤维化程度加重而升高。

图1A：CD158b与CD159e散点图；1B：CD158b与NKG2D散点图；1C：CD159e与NKG2D散点图

图1CD158b、CD158e及NKG2D相关性散点图

表2 CD158b、CD158e及NKG2D在不同肝纤维化程度中的表达水平比较

六、 CD158b、CD159e及NKG2D联合检测诊断严重肝纤维化(S4)的效能分析

单指标诊断严重肝纤维化时，NKG2D诊断的效能最高，其次为CD158b，CD159e最差；CD158b、CD159e及NKG2D联合检测诊断严重肝纤维化的的Logistic回归方程为F=-21.850+0.131CD158b+0.276CD158e+0.124NKG2D，其诊断严重肝纤维化的效能高于单指标诊断，AUC联合检测>AUCCD158b，AUC联合检测>AUCCD159e，AUC联合检测>AUCNKG2D(Z=3.332、3.031、2.956，P=0.001、0.002、0.003)。

讨 论

据估计目前全世界约有2亿CHC患者是由HCV感染引发，其中70%～80%CHC患者会发展为肝纤维化[6]。近年来，NK细胞与肝纤维化的关系日益受到关注，有研究表明激活NK细胞抑制受体的表达与肝纤维化的严重程度相关[7]。因此本文通过探讨NK细胞抑制受体的水平变化特点与CHC患者肝纤维化程度的关系，以期为CHC患者的病情及肝纤维化程度判定提供新的方法。

表3 CD158b、CD158e及NKG2D与临床病理的关系

表4 CD158b、CD159e及NKG2D联合检测诊断严重肝纤维化的效能

图2 CD158b、CD159e及NKG2D联合检测诊断严重肝纤维化的ROC曲线

本研究选取的135例CHC患儿中，肝功能异常组血清中NK抑制受体的表达水平明显高于肝功能正常组，提示肝功能异常会导致CD158b、CD159e及NKG2D表达水平升高。HCV对肝脏的感染会导致机体免疫力降低[8]，加重肝纤维化。本研究结果显示，随着肝纤维程度的加重，NK细胞抑制受体CD158b、CD159e及NKG2D表达增加，可能原因是各种致病因子导致肝内缔结组织异常增生，致使CD158b、CD159e及NKG2D表达水平增高，降低NK细胞抗病毒的活性，导致机体对抗病毒的能力下降，提示肝纤维化程度的加重会导致NK细胞的活性降低，致使机体自身免疫功能下降，与Li等[9]研究结果一致。本研究病理资料分析结果表明，CD158b、CD159e及NKG2D的水平在肝硬化及未接受抗病毒治疗患儿的水平升高，提示CD158b、CD159e及NKG2D表达水平与严重肝纤维程度有关。除此之外，若CHC未接受抗病毒治疗，其机体NK细胞抵抗丙型肝炎病毒时，由于慢性丙型肝炎细胞因子的暴露会诱导NK细胞毒性过度表达，因此CD158b、CD159e及NKG2D表达水平升高，与Mania A等[10]研究结果一致。本研究结果显示，不同严重程度肝纤维化患者CD158b、CD158e及NKG2D水平差异明显，其水平随肝纤维化程度的加重而升高，提示CD158b、CD158e及NKG2D有望成为判别肝纤维化分期的诊断指标。ROC曲线分析显示，NKG2D诊断严重肝纤维化的效能良好，敏感度及特异性均较高；而CD158b、CD159e单项诊断严重肝纤维化的效能均低于NKG2D对严重肝纤维化的诊断效能，提示CD158b、CD159e和NKG2D单指标对严重肝纤维化均有较好的诊断效能，NKG2D的诊断准确率更好，可以作为肝纤维化程度诊断的指标。本研究将CD158b、CD159e及NKG2D联合诊断与三者单独诊断进行比较，结果显示，CD158b、CD159e及NKG2D联合检测诊断严重肝纤维化的诊断效能明显高于CD158b、CD159e或NKG2D单指标诊断效能，且三者联合诊断模型对严重肝纤维化具有较好的敏感度及特异性，提示CD158b、CD158e及NKG2D联合诊断模型有助于严重肝纤维化的早期的诊断。

综上所述，CD158b、CD159e及NKG2D在CHC肝纤维化患儿体内表达水平较高，且随着患者肝纤维化程度的加重而升高。三者联合检测能够较为准确地评估肝纤维化程度，有助于严重肝纤维化的早期的诊断。然而本研究样本量较少，且NK细胞抑制受体在肝纤维化过程的表达机制尚不完善，下一步将扩大样本量，并完善其表达机制。