“一步法”制备核壳式Ag-MIP及对苯唑西林的SERS检测

李轩，李利军，程昊，冯军，刘腾，徐娅娟

(1.广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545000；2.广西科技大学 广西糖资源绿色加工重点实验室， 广西 柳州 545006；3.广西蔗糖产业协同创新中心，广西 南宁 530004；4.广西科技大学 广西高校糖源加工重点实验室，广西 柳州 545006)

抗生素是20世纪最重要的医学发明之一，在治疗许多致命的传染病方面具有较好的效果，但抗生素药物的过度使用导致抗药性细菌增多，从而影响一些疾病的治疗[1-3]。苯唑西林(Oxacillin)作为抗生素，常被用来治疗病菌感染类疾病，但在动物的饲养过程中过量使用则会造成苯唑西林在动物性食品中残留[4-6]，因此，建立快速、准确的苯唑西林检测方法具有重要的意义。

目前，检测苯唑西林的方法主要有高效液相色谱法[7]、液-质联用(HPLC-MS)[8]和高效液相色谱-紫外(HPLC-UV)[9]等方法，这些方法或比较繁琐，或检测周期长，无法实现快速检测。表面增强拉曼散射(SERS) 利用光子作为分子探针，可以实现对物质的无损、快速检测[10]。

本文以硅烷化试剂APTES为功能单体，苯唑西林为模板分子，TEOS为交联剂，采用“一步法”制备核壳式Ag-MIP微球，以核壳式Ag-MIP微球为基底，利用激光共聚焦拉曼光谱仪，在638 nm激发波长处对苯唑西林溶液进行检测，结果发现，核壳式Ag-MIP基底对苯唑西林具有较强的SERS信号，苯唑西林浓度和特征峰强度具有较好的线性关系，R2为0.975，检测极限达到10-15mol/L。对相同浓度的4-MBA、R6G和苯唑西林混合溶液，Ag-MIP对苯唑西林具有较高的选择性，可较好的排除4-MBA、R6G对SERS光谱采集的干扰。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

硝酸银、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，MW=55 000)、抗坏血酸、苯唑西林、硅酸四乙酯(TEOS)、3-氨基三乙氧基硅烷(APTES)、氨水、无水乙醇、乙腈均为分析纯。

Hitachi S-4800冷场发射扫描电子显微镜；JEM 2100透射电子显微镜；Bruker D8A A25 X射线衍射仪；Frontier傅里叶红外光谱仪；UV-2102PC紫外可见分光光度计；XploRAPLUS激光共聚焦拉曼光谱仪。

1.2 核壳式Ag-MIP微球制备

1.2.1 银微球的制备[11]配制1 mol/L AgNO3溶液作为银源，0.1 mol/L抗坏血酸溶液作为还原剂，1% PVP(聚乙烯吡咯烷酮)溶液作为分散剂。取0.2 mL AgNO3溶液与1 mL PVP溶液分散于10 mL去离子水中，磁力搅拌5 min。迅速滴加2 mL抗坏血酸溶液，反应10 min。离心，分别用去离子水与无水乙醇洗涤3次，40 ℃真空干燥24 h。

1.2.2 Ag-MIP的制备 称取50 mg苯唑西林超声分散于10 mL乙醇-乙腈(1∶1)溶液中，加入450 mL APTES，磁力搅拌30 min。加入200 mL TEOS，超声10 min。加入200 mg Ag微球，超声5 min，待Ag微球分散均匀后，加入6%氨水1 mL，常温下磁力搅拌24 h。离心，用乙酸-水(4∶1)洗涤，直至无苯唑西林检出。最后，分别用去离子水与无水乙醇洗涤3次，40 ℃真空干燥24 h。

1.2.3 Ag-NIP的制备 方法和上述完全相同，只是不加模板分子苯唑西林。

1.3 Ag-MIP吸附性能考察

配制不同浓度的苯唑西林标准溶液，建立标准曲线。分别取2 mL苯唑西林标准溶液与10 mg的Ag-MIP和Ag-NIP在25 ℃振荡24 h，离心，取上清液，检测其紫外吸光度。

1.4 拉曼光谱采集及参数

分别取2 mL不同浓度的苯唑西林标准溶液和苯唑西林、R6G、4-MBA混合溶液，分别与10 mg Ag和Ag-MIP混合，在25 ℃振荡4 h。滴到石英玻璃片上，晾干，采集拉曼光谱。光谱的参数为：波长638 nm，积分时间10 s，平均次数为1次。

2 结果与讨论

2.1 Ag-MIP的表征

2.1.1 Ag、Ag-MIP的SEM和TEM表征 图1分别为Ag和Ag-MIP的SEM和TEM图。

图1 Ag和Ag-MIP的SEM和TEM图Fig.1 SEM and TEM diagrams of Ag and Ag-MIPa.Ag SEM图；b.Ag-MIP SEM图；c.Ag TEM图；d.Ag-MIP TEM图

由图1可知，银微球是由棍棒组成，且表面非常粗糙，Ag-MIP中的Ag微球表面粗糙度降低，且观察不到凸起的棍棒。Ag微球表面包覆了一层透光度较高的薄膜。综上，可以初步确定银微球表面覆盖有聚合物层。

2.1.2 Ag-MIPs的EDS表征 图2为Ag-MIPs 的EDS图。其中的Ag元素谱峰来自于Ag微粒，Si来自于APTES或TEOS，C元素可能来自于APTES、TEOS或PVP。N、S元素来自于模板分子苯唑西林，由此可以进一步证明银微球表面的聚合物为苯唑西林分子印迹聚合物。

图2 Ag-MIP的EDSFig.2 EDS images of Ag-MIP

2.1.3 Ag、Ag-MIPs的XRD表征 图3为Ag、Ag-MIP的XRD谱图。

图3 Ag-MIP(a)和Ag(b)的XRD谱图Fig.3 XRD spectra of Ag-MIP (a) and Ag (b)

由图3可知，在2θ=38.175，4.413，64.630，77.606°处出现了明显的衍射峰，通过与标准PDF卡片(87-0720)对比，这些吸收峰分别为Ag晶体的(111)、(200)、(220)和(311)晶面，Ag-MIP的特征峰位与Ag微球位置完全重合，说明Ag微球表面包覆一层聚合物后，并未导致银微球晶型发生改变，但峰强度变小，其中(111)对应晶面峰的强度降低最大。

2.1.4 Ag、Ag-MIP的IR表征 图4是Ag-MIPs和Ag的FTIR谱图。

图4 Ag-MIP(a)和Ag(b)的FTIR谱图Fig.4 FTIR spectra of Ag-MIP (a) and Ag (b)

由图4可知，Ag微球表面并无其它杂质；从Ag-MIP FTIR可看出，846，1 047 cm-1是来自交联剂TEOS中的Si—O键的特征峰，1 400，1 470，1 470 cm-1是由苯唑西林中的苯环骨架振动引起的，1 550 cm-1是由苯唑西林中C—N键伸缩振动引起的，1 595，1 652 cm-1是由苯唑西林中的酰胺基中的羰基伸缩振动引起的。这些特征峰的出现，进一步证明Ag-MIP制备成功。

2.2 Ag-MIP的吸附等温线

Ag-MIP和Ag-NIP的吸附等温线见图5。

图5 Ag-MIP(a)和Ag-NIP(b)对苯唑西林的吸附等温线Fig.5 Adsorption isotherm of Ag-MIP (a) andAg-NIP (b) for OXA

由图5可知，在10～60 μg/mL的苯唑西林浓度区间内，Ag-MIP与Ag-NIP的吸附量均随着浓度的增大而上升，但Ag-MIP吸附量远高于Ag-NIP，表明Ag-MIP对苯唑西林具有更好的吸附性能，且吸附饱和量为23.6 μg/mg。这是因为Ag-MIP聚合物具有和苯唑西林分子结构相匹配的印迹空穴，从而导致了Ag-MIP对苯唑西林的吸附具有富集效果。

2.3 Ag-MIP的吸附动力学曲线

图6为Ag-MIP和Ag-NIPs的动力学吸附曲线。

图6 Ag-MIP(a)和Ag-NIP(b)的吸附量-时间曲线Fig.6 Adsorption quantity-time curve ofAg-MIP (a) and Ag-NIP (b)

由图6可知，在60 min内随时间增加，Ag-MIP和Ag-NIPs对苯唑西林的吸附速率增大，120 min后开始减缓，360 min时吸附达到饱和。在任何时间段内，Ag-MIP相对于Ag-NIP都具有较大的吸附速率。这是由于Ag-MIP聚合物中具有和苯唑西林分子结构相匹配的印迹空穴，所以Ag-MIP相对于Ag-NIP 表现出较高的吸附速率。

2.4 Ag-MIP的竞争吸附

图7为Ag-MIP和Ag-NIP分别对OXA、4-MBA、R6G分子的吸附效率。

图7 Ag-MIP和Ag-NIP对不同分子的竞争吸附研究Fig.7 Competitive adsorption of different moleculesby Ag-MIP and Ag-NIP

由图7可知，在相同的条件下，Ag-MIP对苯唑西林的吸附效率为83.5%，明显高于Ag-NIP的37.5%。Ag-MIP对4-MBA与R6G的吸附效率分别为50.6%，42.5%。表明Ag-MIP对苯唑西林吸附具有选择性。这是因为Ag-MIP洗脱苯唑西林后，在Ag-MIP表面留下了与苯唑西林分子结构相匹配的空穴，空穴中有与苯唑西林相结合的官能团，从而导致了Ag-MIP对苯唑西林的吸附具有选择性和富集效果。Ag-NIP对4-MBA与R6G的吸附效率分别为42.9%，25.9%，吸附效率相差较大。这是因为Ag-NIP表面的空穴是无规律排列的，没有特殊结构的普通空穴，但4-MBA分子结构相对R6G较小，所以更容易被吸附。

2.5 Ag与Ag-MIP的SERS性能研究

图8(a)、8(b)分别为苯唑西林(10-3mol/L)在Ag-MIP和Ag微球基底上的SERS谱图，8(c)为苯唑西林标准品的拉曼光谱图。

图8 拉曼光谱图Fig.8 Raman spectraa.苯唑西林(10-3mol/L)在Ag-MIP基底上的SERS；b.苯唑西林(10-3mol/L)在Ag微球基底上的SERS；c.苯唑西林标准品的SERS

由图8(c)可知，Ag微球与Ag-MIP在1 092 cm-1(羧基C—O键伸缩振动引起)、1 195 cm-1(苯环C—H键弯曲振动引起)、1 600 cm-1(苯环C—C键伸缩振动引起)处拉曼峰显著增强[12-13]，因此，可分别作为Ag微球与Ag-MIP基底上苯唑西林的特征峰。在相同浓度的苯唑西林溶液中，Ag-MIP的特征峰强度显著高于Ag微球。这是因为Ag-MIP对苯唑西林的选择性吸附，使Ag-MIP上的苯唑西林分子数量增大，所以具有较强的SERS信号。

2.6 Ag-MIP的SERS检测极限

图9是不同浓度苯唑西林溶液的SERS谱图。

图9 Ag-MIP吸附不同浓度苯唑西林溶液的SERS谱图Fig.9 SERS spectra record for Ag-MIP in differentconcentration of OXA solution

由图9可知，随着苯唑西林浓度的降低，对应的峰强度也相应减弱。当苯唑西林溶液的浓度为10-15mol/L时，吸收峰强度极弱。这是由于随着苯唑西林溶液浓度的降低，Ag-MIP吸附的苯唑西林分子减少，激光照到单位面积的苯唑西林分子也随之逐渐减少，从而导致拉曼光谱的信号逐渐减弱。因此，可将10-15mol/L视为Ag-MIP的检测极限。

为了考察不同浓度的苯唑西林与其SERS的线性相关性，以图8中1 092 cm-1处的特征峰为参照，logc为横坐标，特征峰强度为纵坐标，在浓度10-3～10-13mol/L 范围内作线性拟合，见图10。线性回归方程为y=893.74x+12 221，R2=0.975。

由图10可知，苯唑西林浓度与SERS信号峰强度之间存在较好的线性关系，说明可以通过测量特征峰强度实现对苯唑西林的定量分析。

图10 浓度与峰强度的线性关系图Fig.10 The liner relationship betweenconcentration and peak intensity

2.7 Ag-MIP的SERS竞争吸附

图11分别是Ag和Ag-MIP吸附苯唑西林、4-MBA和R6G混合溶液后的SERS谱图。

图11 SERS谱图Fig.11 SERS spectraa.苯唑西林、4-MBA和R6G混合溶液在Ag-MIP基底上SERS；b.苯唑西林、4-MBA和R6G混合溶液在Ag基底上的SERS

由图11可知，在600～1 800 cm-1范围内，以Ag-MIP作为基底时，苯唑西林的特征峰较为明显，4-MBA和R6G的特征峰较低，基本被苯唑西林的特征峰覆盖。而以Ag作为基底时，苯唑西林、4-MBA和R6G的特征峰都较为明显。这是因为Ag-MIP聚合物中具有和苯唑西林分子结构相匹配的结合位点，可以选择性吸附苯唑西林分子。对比图8(a)，可知，苯唑西林的特征峰蓝移，且相对强度也有所变化，这可能是少量的4-MBA和R6G吸附导致。

3 结论

采用“一步法”制备出核壳式Ag-MIP微球，粒径均一，分散性好。以核壳式Ag-MIP微球作基底，对苯唑西林的拉曼光谱具有显著的增强效应，同时对苯唑西林具有优异选择吸附性，因此，可用于苯唑西林的高灵敏度、高选择性的SERS检测。