基于美拉德反应制备的熟制黑枸杞加工工艺及活性成分变化规律

胡云峰，王晓彬，陈君然*，朱彦华

1(省部共建食品营养与安全国家重点实验室(天津科技大学)，天津，300457) 2(早康枸杞股份有限公司，宁夏 中宁，755100)

熟制黑枸杞是一种将枸杞(LyciumbarbarumL.)在特定温、湿度条件下加热熟制后制成的黑色枸杞产品，是基于美拉德等一系列复杂反应后得到的，不同于天然黑果枸杞。美拉德反应(maillard reaction，MR)是氨基酸或蛋白质中含有的氨基和糖类中的羰基在加热条件下发生的复杂反应[1-2]，反应过程中会产生大量的中间产物(maillard reaction products，MRPs)，它们不仅可改善产品色泽、风味，还具有多种活性，如抗氧化、抑菌、抗炎等[3-4]。因此，美拉德反应广泛存在并应用于中药炮制过程中。中药素有“生熟异治”的说法，经炮制后的中药化学成分发生变化，活性成分的增减导致其药性改变，同时炮制也会赋予其特殊的“药香”，缓和药物气味，这些成分的变化经证明均是由MRPs带来的[5-6]。

美拉德反应过程中会产生大量的呈色物质，如类黑素等，使产品表现出良好的色泽[7]。同时，美拉德反应产生的复杂的杂环化合物赋予食品独特的风味[8]。王旭等[9]研究表明，等量的葡萄糖和不同的氨基酸如Gly、Ala、Tyr、Asp、Val、His、Lys、Pro和Phe于180 ℃下反应可产生焦糖香气、巧克力香气和特殊的紫罗兰香气。除改善产品感官品质外，李芳菲等[10]研究表明，MRPs具有强抗氧化性，能够抑制脂肪氧化酸败，保持肉糜鲜亮，延长肉糜保质期。本试验以枸杞为原料，基于美拉德反应制备熟制黑枸杞，并对其加工工艺及品质变化规律进行相关研究，为枸杞的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冻干枸杞：水分质量分数为3%，宁夏中宁早康枸杞股份有限责任公司； PP聚丙烯托盘，天津恺瑞康科技有限公司，规格为25 cm×15 cm×2 cm。

无水乙醇、葡萄糖、浓硫酸、没食子酸、NaOH,均为分析纯，天津市北方天医化学试剂厂；苯酚(分析纯)，天津市化学试剂三厂；福林酚(生化试剂)，上海索莱宝生物科技有限公司；芦丁(生化试剂)，天津一方科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DL-101型电热恒温鼓风干燥箱，天津市中环实验电炉有限公司；CR-10型自动测色色差计，柯盛行仪器有限公司；MP522型精密pH/电导率仪，成都锐新仪器仪表有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；PL203/01电子分析天平，特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.3 熟制黑枸杞制备工艺优化

称取一定量冻干枸杞，加入枸杞总质量30%的蒸馏水后，均匀放置于托盘中，托盘用塑料膜封口后置于恒温恒湿箱中，分别于50、60、70和80 ℃条件下熟化处理一定时间，即得到熟制黑枸杞，每隔4 h对MRPs反应程度和褐变度、pH值、色泽以及水分含量进行测定。

1.4 枸杞熟化过程中品质变化规律研究

采用优化的工艺，制备熟制黑枸杞，对熟制过程中的枸杞定期取样，分析测定活性物质的变化情况。

1.5 指标测定

1.5.1 MRPs反应程度和褐变度测定

采用比色法测定枸杞熟制过程中MRPs和褐变度[11]，每4 h取样测定。取不同处理时间的熟制黑枸杞粉稀释适当倍数，溶解、过滤、4 000 r/min离心15 min，测定其上清液在294、420 nm下的吸光度值。

1.5.2 色泽测定

参照贺帆等[12]的方法，用CR-10型自动测色色差计进行测定。每次随机选取5颗枸杞，在每个枸杞果实的表面取相同位置的点测定亮度L*、红绿度a*值和黄蓝度b*值，结果取平均值。同时按照公式(1)计算枸杞的色差值ΔE。

(1)

式中：ΔE称为色差值，是描述颜色与标准颜色间差异程度的指标；L*、a*、b*为标准颜色色度值。

1.5.3 水分测定

参照GB/T 5009.3—2016《食品中水分的测定》中的直接干燥法。

1.5.4 pH值测定

取一定质量枸杞按比例添加蒸馏水，溶解，使用MP522型精密pH/电导率测定仪测定pH值，每个样品平行测定3次，取平均值。

1.5.5 枸杞活性物质测定

参照付艳丽等[13]的苯酚-硫酸法测定枸杞多糖。枸杞中多酚的测定参照陈晨等[14]的紫外分光光度法。黄酮类化合物参照张颖等[15]的比色法进行测定。

1.5.6 感官评价

按照表1对熟制黑枸杞进行感官评价。

表1 感官评价标准

1.6 数据处理方法

采用SPSS 17.0 软件的one-way ANOVA对重复性试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 熟制黑枸杞制备工艺优化

2.1.1 不同温度及处理时间对MRPs反应程度的影响

美拉德反应初级阶段产生酮类及醛类等小分子化合物，这类化合物在294 nm处有特征吸收峰，因此294 nm的吸光值可反映美拉德反应所生成的MRPs的量，MRPs积累量能反映美拉德反应程度[16]。如图1所示，各处理组在反应初期，吸光度值均剧烈升高，随后开始趋于平缓。分析原因主要是反应初期，反应底物充分，迅速产生大量的中间产物(MRPs)，随着反应底物逐渐被消耗，中间产物生成反应开始趋于停止。

由图1可见，不同温度对熟制黑枸杞美拉德反应进程的程度影响不同，加热温度为80 ℃时，美拉德反应在12 h已基本结束；而70 ℃时，结束时间为24 h左右，与80 ℃相比，美拉德反应时间延长了12 h。当熟化温度为60 ℃时，美拉德反应达平稳时间延长至48 h；50 ℃时反应结束时间约为68 h。说明温度越高，反应速率越快，达到相同吸光度值的时间越短，说明美拉德反应越剧烈。

图1 处理温度对MRPs形成的影响

Fig.1 Effect of treatment temperature on content of intermediate products in MRPs

2.1.2 温度及处理时间对MR褐变度的影响

在美拉德反应过程中，类黑精是末期产生的一类棕褐色高分子物质，在一定范围内，反应时间越长，类黑精生成量越多，样品颜色越深，褐变程度随之加剧，420 nm处的吸光度值可以反映美拉德反应褐变程度[7]。从图2中可以看出，80 ℃加工条件下，枸杞褐变度升高趋势最为剧烈，褐变产物生成速度最快，50 ℃加工条件下褐变度升高趋势最为平缓，褐变产物生成速度最慢，说明黑枸杞熟制过程中美拉德反应随温度的升高而加剧，温度越高，美拉德反应越剧烈，褐变产物生成速度越快。

图2 处理温度对美拉德反应体系褐变度的影响

Fig.2 Effect of treatment temperature on content of endproducts in MRPs

2.1.3 温度及处理时间对熟制黑枸杞pH值的影响

在熟制过程中，由于氨基酸的碱性基团氨基与还原糖的羰基进行缩合，使得游离的氨基基团数量下降，从而体系的pH值不断下降，因此pH值下降的程度是衡量美拉德反应剧烈程度的一个指标。由图3可知，体系pH值随处理时间的延长而不断降低，在处理初期，pH值下降速率较快，随着处理时间的延长，pH值下降速率减缓。

图3 处理温度对枸杞pH值的影响

Fig.3 Effect of treatment temperature on the pH value of Lycium barbarum L.

80 ℃条件下处理12 h时，pH值已基本稳定，达到4.74，而70 ℃条件下需处理24 h，随着温度的下降，达到相同pH值的处理时间增加，50 ℃条件下处理时间需延长至约64 h，是80 ℃条件下的5.3倍左右。随着反应温度的升高，反应产物的pH值降低速率明显加快，说明反应进程随温度的升高而不断加速，这与大量研究结果一致[26-27]。

2.1.4 温度及处理时间对熟制黑枸杞色泽的影响

美拉德反应产物——类黑精是导致枸杞在干制处理过程中颜色由红色变为黑色的主要物质，因此可以通过美拉德反应产物的色泽变化，定性判断美拉德反应程度[19-20]。试验以L*、a*值和ΔE分析反应程度，由图4可见，不同温度条件下枸杞的L*、a*值均随着时间的延长呈现下降趋势，ΔE随着时间的延长呈现上升趋势。且温度越高，变化趋势越明显。但在熟化处理后期，L*、a*值和ΔE变化趋于平缓，说明类黑精的生成速率趋近于0。

图4 处理温度对枸杞色泽的影响

Fig.4 Effect of treatment temperature on the color of Lycium barbarum L.

由各处理组的色差变化趋势及变化幅度达到较大值的时间，可以推断出一个有效的反应时间范围，即 50 ℃，64 h；60 ℃，48 h；70 ℃，24 h；80 ℃，12 h。

2.1.5 温度及处理时间对熟制黑枸杞水分含量的影响

枸杞属高水分含量的浆果，在干制初期，过高的温度会造成枸杞组织内部气体迅速膨胀，致使组织被压破，发生开裂现象从而造成产品破损、营养物质流失[30]。如图5可知，枸杞水分含量随处理时间的延长而不断降低。80 ℃条件下枸杞水分含量一直处于较低水平，处理56 h后枸杞内水分含量由32.74%下降到20.40%，下降了12%左右。

图5 不同处理温度对枸杞水分含量的影响

Fig.5 Effect of treatment temperature on the moisturecontent of Lycium barbarum L.

与80 ℃相比，枸杞在60和70 ℃条件下熟化处理时，水分含量略高，其中60 ℃干制条件下处理56 h后,水分含量下降到22.38%，已达到干制要求。50 ℃熟化处理时,枸杞水分含量处于较高水平。说明处理温度对干制过程中枸杞水分含量变化有较大影响，处理温度越高，枸杞的失水速率越快，达到干制要求所需时间越短。

2.1.6 温度及处理时间对熟制黑枸杞感官品质的影响

对不同干燥温度下得到的熟制黑枸杞进行感官评价，结果如表2所示。不同温度下，熟制黑枸杞感官品质顺序为：60 ℃>70 ℃>50 ℃>80 ℃。处理温度过高时，熟制黑枸杞品质相对较差，这是因为，过高的温度经美拉德反应制备的熟制黑枸杞苦焦味较重，且色泽不均一，与位锦锦的研究一致[22]。

表2 熟制黑枸杞的感官品质

有研究表明，枸杞初期干燥温度若高于70 ℃，鲜枸杞易爆裂，加工成的干制品易出现褪色现象，导致成品色泽不均匀[23]。温度过低时，得到熟制黑枸杞的处理时间延长，能耗增加。因此选择适当的温度及熟化处理时间至关重要。60 ℃条件下美拉德反应赋予枸杞独特的药香味，使产品具有较好的质地及口感。因此综合熟制黑枸杞品质和能耗问题，选择60 ℃熟化效果较好，此时的熟化时间为48 h。

2.2 枸杞熟化过程中活性成分变化规律

2.2.1 枸杞熟化过程中多糖含量变化

枸杞多糖是一种水溶性多糖，随美拉德反应时间的增加，枸杞多糖含量呈下降趋势，这是因为美拉德反应是羰基化合物(还原糖类)和氨基化合物(氨基酸和蛋白质)的反应，反应底物随时间的延长而逐渐被消耗，导致枸杞多糖含量降低。处理前4 h，枸杞多糖含量下降迅速，由初始的23.75 mg/g下降到19.91 mg/g。4 h后，枸杞多糖含量降低速率减缓，处理至48 h时，枸杞多糖含量为6.01 mg/g，与初始相比，下降了3.95倍。

2.2.2 枸杞熟化过程中多酚含量变化

枸杞熟化过程中，加热时间越长，枸杞的总酚含量积累越多。

图6 枸杞熟化过程中多糖含量变化

Fig.6 The change of polysaccharide content of theLycium barbarum L. during ripening reaction注：不同小写字母表示差异显著，P<0.05,下同。

由图7可知，在整个处理过程中，处理前4 h，枸杞总酚含量上升速度较慢，由10.34 mgGAE/g上升到10.79 mgGAE/g，分析原因可能是在处理前期，枸杞内的多酚氧化酶在60 ℃仍有部分活性，这与文献报道一致，因此枸杞中的总酚部分被多酚氧化酶催化形成醌及其聚合物[24]。在处理4 h后，枸杞的多酚氧化酶活性大大降低，枸杞总酚含量上升速度加快，最终为22.94 mgGAE/g。

图7 枸杞熟化过程中多酚含量变化

Fig.7 The change of polyphenols content of theLycium barbarum L. during ripening reaction

在60 ℃干制过程中，枸杞总酚含量呈现上升的趋势，在这过程中可能会有部分多酚类物质被破坏，但大部分多酚类物质随着干制过程的进行而积累。

2.2.3 枸杞熟化过程中黄酮含量变化

枸杞黄酮含量随着处理时间的变化规律如图8所示,枸杞黄酮含量在整个反应过程中随着处理时间的延长而上升。在处理0 h时，枸杞黄酮含量仅为1.88 mgRE/g，24 h时黄酮含量为5.25 mgRE/g，处理至48 h时，枸杞黄酮含量上升至8.10 mgRE/g，为反应初始时黄酮含量的4.31倍。因此对枸杞进行熟制处理会使枸杞黄酮含量积累，这与李朋亮等的研究结论一致[34]。

图8 枸杞熟化过程中黄酮含量变化

Fig.8 The change of flavonoids content of the Lyciumbarbarum L during ripening reaction

3 结论

确定了熟制黑枸杞的最佳熟化温度和时间：60 ℃熟化48 h。此条件下制备出的熟制黑枸杞果肉较柔软、厚实，味道酸甜，有独特的药香味，口感协调，颜色呈均一的黑色。最佳工艺下熟制黑枸杞内枸杞多糖下降了3.95倍，但多酚类物质与黄酮含量显著升高，其中多酚类物质在熟化48 h后，升高为熟化前的2.22倍；黄酮含量上升至8.10 mgRE/g，为反应初始黄酮含量的4.31倍。枸杞多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗辐射等作用，但是过量食用会引起上火现象，尤其对于体内有炎症或易腹泻的人群不宜过多食用，实验制备的熟制黑枸杞，虽枸杞多糖含量有所降低，但是多酚类物质与黄酮含量显著升高，提高了枸杞的抗氧化活性，一定程度上提高了枸杞的附加值。

4 讨论

本研究基于美拉德反应制备熟制黑枸杞，将枸杞经过高温熟化使其充分发生美拉德反应，制备的熟制黑枸杞颜色为均一的黑色，味道酸甜，并具有独特的药香味。本试验在枸杞熟制过程中枸杞多糖含量呈下降趋势，这是因为美拉德反应是羰基化合物(还原糖类)和氨基化合物(氨基酸和蛋白质)间的反应，反应底物随时间的延长而逐渐被消耗，导致枸杞多糖含量降低。美拉德反应不仅赋予产品独特的风味，而且在反应过程中物质成分会发生变化。王桂欣[26]研究表明，枣粉在热加工过程美拉德反应产生的类黑精、还原酮类物质在脂质氧化过程中作为电子供体打破自由基链式反应并减少氧化中间体，从而达到清除自由基的目的。陈善信等[27]比较了不同炮制品中黄酮的含量变化，结果表明，醋炒槐米和炒槐米均可使黄酮含量增加，炮制过程中，槐米中的一些有机质被破坏而致芦丁含量相对增加。崔春兰等[28]研究表明，大蒜在美拉德反应过程中多酚和黄酮含量呈上升趋势，这些活性物质的增加也促进其抗氧化能力的增强。本试验中制备的熟制黑枸杞内枸杞多糖含量下降，但多酚类物质与黄酮含量显著升高，且随着熟化时间的延长，枸杞内类黑素的积累增加，对枸杞抗氧化活性的提高具有积极影响，与上述研究结果一致。