耐药性颞叶癫痫大鼠海马组织γ-氨基丁酸A、B受体表达观察

陈姝璇，康杨婷，石海燕，伍国锋，王丽琨

(贵州医科大学附属医院，贵阳550004)

癫痫是多种原因导致的脑部神经元高度同步化异常放电的临床综合征，以反复的自发性发作为主要特征。约有30%的癫痫患者经过系统正规的药物治疗，仍不能得到有效控制，成为耐药性癫痫,耐药性癫痫反复发作会给患者心理、认知等方面带来严重的负面影响，同时也增加患者的病死率[1,2]。有研究显示，癫痫的发生可能是由于神经系统的抑制性递质和兴奋性递质的不平衡引起的。中枢神经系统中神经元激发的调控主要是通过抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)进行，GABA与GABA受体结合后可发挥抑制作用。GABA受体分为离子型GABAA受体和代谢型GABAB受体。GABAA受体可介导抑制性突触后电流从而对癫痫发作产生抑制作用[3,4]。GABAB受体可调节神经元突触神经递质的释放和迟发性抑制性突触后电位，在控制癫痫的兴奋性方面起重要作用[5]。目前，GABA受体与癫痫耐药是否有关仍未明确。2014年9月～2017年7月，我们建立了耐药性颞叶癫痫大鼠模型， 观察了GABA受体表达变化。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 SPF级健康成年雄性SD大鼠60只,体质量200～250 g,日龄50～60 d，由贵州医科大学实验动物中心提供。实验前将动物置于实验室1周适应环境，单笼喂养，自由进食和饮水，室温21～25 ℃，自然采光，无自发性癫痫发作的大鼠入选。BL-420F生物机能实验系统、DW-2000脑立体定向仪、HF30型可拆式屏蔽室(中国成都泰盟科技有限公司)，苯妥英钠(中国武汉远城科技发展有限公司)，苯巴比妥钠(中国上海新亚药业有限公司)，小型垂直电泳槽、全湿电转印装置、凝胶成像分析系统(美国加州Bio-Rad公司)，Anti-GABAA antibody、Anti-GABAB antibody(美国Abcam公司)，HRP-RAbbit Anti-Chicken IgY(IgG)、PV6001-3ml 兔kit、TRIS、酶标条12孔、SDS、甲醇(中国北京鼎国昌盛生物技术有限公司)。

1.2 耐药性颞叶癫痫模型的建立及鉴定 氯化锂125 mg/kg腹腔注射，18～24 h后给予硫酸阿托品1 mg/kg腹腔注射，30 min后首剂腹腔注射匹罗卡品30 mg/kg，30 min后若无Racines分级[6]Ⅳ级以上发作，可每隔30 min注射10 mg/kg追加剂量，直至出现Ⅳ级以上无明显间歇的癫痫持续状态。注射匹罗卡品后，若大鼠反复出现IV～V级发作视为大发作，即氯化锂-匹罗卡品癫痫模型建立成功。氯化锂-匹罗卡品癫痫模型建立成功2周后，给予苯巴比妥25 mg/kg，1次/d,连续给予2周，然后记录大鼠癫痫发作频率及持续时间。若用药后癫痫发作频率和持续时间减少≥50%为对苯巴比妥敏感，即药物敏感癫痫大鼠；若氯化锂-匹罗卡品癫痫模型大鼠癫痫发作频率和持续时间减少<50%为对苯巴比妥耐药的癫痫大鼠，此时需选择第2种抗癫痫药苯妥英钠75 mg/kg，1次/d,连续给予2周；若癫痫发作频率和持续时间减少<50%为对苯妥英钠耐药，对苯巴比妥和苯妥英钠均耐药的大鼠为耐药型大鼠[7]。本研究中SD大鼠60只，成功建立氯化锂-匹罗卡品癫痫模型25只，使用苯巴比妥和苯巴比妥耐药性筛选后筛选出药物敏感16只，耐药癫痫大鼠9只。用随机数字法从敏感大鼠中选取8只作为药物敏感组，从耐药大鼠中选取8只作为耐药组，再选择8只正常SD大鼠作为对照组。观察、记录并分析各组大鼠癫痫发作程度、发作级别，并将各组癫痫大鼠的大脑右侧海马植入电极，连接于脑电图记录仪，观察并记录脑电图的频率、波幅变化。药物敏感组癫痫发作次数、发作级别、发作持续时间分别为(1.43±1.10)次、(2.63±0.52)级、(35.38±2.92)s，耐药组分别为(3.96±1.12)次、(4.88±0.35)级、(66.75±5.73)s。与药物敏感组比较，耐药组癫痫发作次数增加，发别级别升高，发作持续时间延长(P均<0.05)。脑电图提示典型的癫痫波型有单棘波、多相棘波、双相棘波、棘慢波、阵发性高幅尖波节律，其中以多发棘波为主且频繁出现。耐药组发作前以快波和单棘波为主，发作前、发作时癫痫波频率、波幅及发作后波幅高于药物敏感组(P均<0.05)，见表1。以上结果提示耐药性颞叶癫痫模型建立成功。

表1 癫痫发作前、中、后两组脑电图癫痫波频率、 波幅比较

注：与药物敏感组同时间相比，＊P<0.05。

1.3 三组海马组织GABAA受体和GABAB受体的检测 ①采用免疫组织化学染色法检测海马组织GABAA受体、GABAB受体。10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射大鼠，待大鼠麻醉后应用冷生理盐水及4%多聚甲醛灌注，取含有海马结构的2～3 mm厚冠状切面脑组织，固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡、水化，于3%过氧化氢室温孵育10 min，PBS冲洗3次×5 min，后选用乙二胺四乙酸二钠修复抗原，待冷却后给予PBS冲洗3次×5 min，滴入正常山羊血清工作液，室温孵育10 min，倾去血清，滴加一抗，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3次×5 min，每张片加入50 U二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次×5 min，每张片加DAS染色液100 μL，苏木素复染，脱水、透明、封片。以细胞膜或细胞质中出现棕黄色物质者判定阳性细胞。PBS代替一抗为阴性对照。利用MIAS图像分析系统在400倍视野下每张切片选择5处阳性细胞测定其平均光密度值(MOD)。②采用蛋白质免疫印迹法检测海马组织GABAA受体、GABAB受体。将大鼠麻醉后断头取脑，取出海马组织放入研磨器，加入裂解液和PMSF(终浓度为1 mmol/L),充分匀浆后，4 ℃、120 000 r/min离心15 min取上清，蛋白定量后，加入5×上样缓冲液混匀，将其置入沸水中，煮沸5 min，使蛋白变性。用移液器将按比例配好的8%的分离胶10 mL缓慢加入制胶板中，避免气泡产生，再将5%的浓缩胶灌于玻璃板中，立即将干净的梳子插入浓缩胶。每例蛋白样品按4∶1的比例在样品中加入4×加样缓冲液，加入蛋白质Marker，初电压80 V电流强度进行电泳，至分离线后调电压至120 V，当目的蛋白泳动至距胶下缘1 cm以上结束。将滤纸、PVDF膜切成与凝胶尺寸大小一致，用两张大滤纸贴于两张多孔垫料，将PVDF膜夹于中间成三明治结构，4 ℃、250 mA恒流转移2 h。PVDF膜用PBS冲洗15 min×2次，封闭液中摇荡1 h后用TBST洗3遍，加入一抗4 ℃过夜后用TBST洗3遍。过夜后孵育二抗1 h,洗膜5 min×3次,将发光液A和发光液B按1∶1比例混匀倒在PVDF膜上，发光液盖住膜即可，曝光。蛋白质免疫印迹法所检测的蛋白条带采用Image J测量软件分析，计算累计光密度(IOD)值,采用目的条带的IOD值/对应的内参(β-actin，GAPDH)IOD值得出IOD比值表示目的蛋白相对表达量。

2 结果

免疫组化染色法检测海马组织GABAA受体、GABAB受体结果显示，对照组大鼠海马组织的细胞膜和细胞质可见大量棕黄色或棕褐色GABAA受体颗粒，颜色深；药物敏感组仍可见大量棕褐色GABAA受体颗粒，但较对照组少；耐药组仅可见少量棕褐色GABAA受体颗粒(图1)。对照组大鼠海马组织的细胞核和细胞质可见大量棕黄色或棕褐色GABAB受体颗粒，颜色深；敏感组仍可见大量棕褐色GABAB受体颗粒，但较对照组少；耐药组仅可见少量棕褐色GABAB受体颗粒(图2)。三组GABAA、GABAB受体MOD值、IOD值比较见表1。

表1 三组海马组织GABAA、GABAB受体表达比较

注：与对照组比较，#P<0.05，与药物敏感组比较，*P<0.05。

图1 三组GABAA受体的表达(免疫组化法)

图2 三组GABAB受体的表达(免疫组化法)

图3 三组GABAA受体和GABAB受体的表达

3 讨论

癫痫是常见的神经系统疾病，其临床表现为抽搐发作，具有反复发作和不可预测性，然而，目前癫痫及耐药性癫痫的病因大多未可知[7，8]。应用动物癫痫模型及大量的动物实验来揭开耐药性癫痫的病因及本质为目前研究癫痫的主要方法。本研究中应用氯化锂-匹罗卡品成功建立癫痫大鼠模型，该模型操作较方便，可直观观察记录用药前后癫痫发作时间、发作频率、发作次数等指标以观察癫痫大鼠对抗癫痫药物的反应性，适合于临床药物筛选的研究，也可用于研究癫痫发作的机制[9]，是较理想动物癫痫模型。本研究中，在癫痫发作时，耐药组及药物敏感组癫痫大鼠均有脑电图改变，可见棘波、尖波、尖慢波等癫痫样波，提示颞叶癫痫模型建立成功。

只有在普通癫痫模型的基础上经过作用机制不同的2种抗癫痫药物治疗足够时间，仍然无效才能认为是耐药性癫痫模型。Bethmann等[10]用苯巴比妥及苯妥英钠对杏仁核点燃癫痫大鼠模型进行筛选，结果发现对苯巴比妥耐药的癫痫大鼠中，80%左右对苯妥英钠也耐药。这两种抗癫痫药物是作用机制完全不同的一线抗癫痫药，苯巴比妥作用于γ-GABA受体，激活氯离子通道导致突触后模超极化，从而抑制突触后神经元的活动；而苯妥英钠为钠通道阻滞剂，阻断钠离子内流从而抑制癫痫病灶内神经元的激活。本研究中我们也选用此两种药物作为耐药性癫痫的筛选，成功建立了耐药性颞叶癫痫模型。本研究结果显示，与药物敏感组比较，耐药组癫痫发作次数增加、发别级别升高、发作时间延长。耐药组发作前癫痫波(发作前主要以快波和单棘波为主)频率，发作时频率、波幅及发作后波幅高于药物敏感组，提示耐药癫痫模型成功建立。

在癫痫发病机制中，一致的观点是癫痫脑组织内存在兴奋功能与抑制功能的病理性失衡，即以谷氨酸为代表的兴奋性神经递质系统功能增强或以GABA为代表的抑制性神经递质系统功能减弱[11]。在癫痫患者与癫痫动物的脑组织中存在GABA抑制性中间神经元的丢失[12]以及GABAA受体介导的抑制性神经元的紊乱[13]，癫痫发作与GABA的释放、免疫活动和结合位点的变化相关。GABAA受体受癫痫持续状态的影响而发生改变。研究[14]发现，急性期癫痫发作能抑制GABAA受体的功能，GABAA受体的拮抗剂有助于诱导癫痫的发作，而能提高GABAA神经传递功能的药物则具有抗惊厥作用。GABAB受体也参与了癫痫活动 ，在癫痫动物的海马中，GABAB受体减少[15]，缺乏GABAB受体的转基因小鼠表现出全身性癫痫发作活动，GABAB受体拮抗剂可诱发或加重癫痫发作活动[16]。在癫痫患者的海马中GABAB受体在突触前降低，改变突触前后神经细胞抑制性突触后电位[17]，从而诱发癫痫发作。

癫痫耐药的重要原因之一为治疗靶点对抗癫痫药物失去反应性。GABA受体门控氯离子通道在癫痫耐药的发生发展中作用突出，脑细胞外液GABA含量减少可以触发癫痫发作并维持癫痫状态存在[18]，增强GABA系统的功能是难治性癫痫治疗的重要策略。GABAA受体在脑内主要由2个α1、2个β2和1个γ2亚基组成。改变GABAA受体亚型,比如α1、α5、γ2可能与抗癫痫药物的耐药密切相关[19]，且GABAA受体可能是耐药性癫痫治疗的靶点[20]。GABAA受体γ2亚基被认为是苯二氮唑类药物的作用靶点[21]，其被证明与癫痫发作、神经退化及抗癫痫药物的耐药密切相关[22]。 本研究表明，与药物敏感组比较，耐药组癫痫大鼠癫痫发作级别升高，持续时间延长及发作次数增加，海马组织GABAA和GABAB受体表达降低，可能是耐药性癫痫大鼠脑组织中抑制性神经递质GABAA、GABAB受体降低，导致GABAA和GABAB受体介导的中枢神经系统的抑制性作用减弱，促进痫性反复发作。

综上所述，在耐药性癫痫大鼠海马组织中GABAA受体和GABAB受体表达降低，癫痫发作明显加重，提示GABA受体可能参与了癫痫发生耐药的机制。本文不足之处在于仅发现了在耐药性癫痫中GABAA和GABAB受体降低，但并没有探讨其降低的原因及引起耐药性癫痫的机制，有待进一步探讨。