生物防腐剂聚赖氨酸研究进展

冯艳芸，郭海娟，李海亮，康馨元

（中华人民共和国宝鸡海关，陕西宝鸡 721006）

近年来，食品腐败变质问题、食品安全问题一直受到全世界人民的密切关注。由于食品腐烂变质给世界农副产品、水产、果蔬等食品产业带来的经济损失不可小觑。然而，长期以来，大多数食品产业是采用化学合成防腐剂和物理杀菌方法来延长食品保质期，这与人们日益增长的对食品营养、感官、外观和安全性的要求相违背。由此可见，这类传统的食品杀菌防腐技术已不能满足人们的需求，而生物添加剂以其安全、有效、对人体无毒副作用的特点得到了研究人员的推崇。ε-聚赖氨酸这种天然的生物代谢产品，以其杀菌能力强、抑菌谱广、水溶性和热稳定性良好的优点，可作为一种安全、高效且不影响食品风味的食品防腐剂，应用于多种农副产品、饮料、营养保健品等之中。ε-聚赖氨酸已经在日本、美国等国家作为食品添加剂得到了广泛的应用，而我国生物添加剂在食品中的应用仍未得到批准，但其特性优点和应用前景已经得到了重视。

1 ε-聚赖氨酸的结构

1977年日本学者S.Shima和H.Saika在从微生物中筛选Dargendorff Positive（DP） 物质时，观察到一株放线菌（白色链霉菌 Streptomyces albulus） 能稳定且大量产生DP物质，通过对产物进行酸水解并进行结构分析得知，该DP物质经证实，其为一种由25～35个赖氨酸残基构成的同型单体聚合物（均聚多肽），赖氨酸单体通过在α-羟基和ε-氨基之间形成酰胺键，由此连接形成均聚氨基酸，称为ε-聚赖氨酸 （ε-poly-L-lysine，ε-PL）[1]。

其化学结构式式如下：

用于食品保鲜剂的ε-PL由30个赖氨酸单体构建而成，分子式为C180H362N60O31，分子质量约为4 700。

2 ε-聚赖氨酸的性质

2.1 ε-聚赖氨酸的理化性质

链霉菌属生产菌产生的代谢产物经分离提取精制，从而获得发酵产品ε-聚赖氨酸，其由25～30个的赖氨酸单体通过在α-羟基和ε-氨基之间形成酰胺键连接形成的多聚体直链。截至目前，相关研究还没有发现其具有确切的二维结构和三维结构。不同菌种产生的ε-PL的单体数（n）不同，聚合度低于10时会失去活性，其分子质量可由 [146.9×n-18.02×（n-1）]公式计算获得。在ε-PL之中分子量在3 600～4 300的抑菌活性最高，其分子量小于1 300时，则失去活性。聚赖氨酸是混合物，所以没有固定的熔沸点，在250℃以上开始软化分解[2]。ε-聚赖氨酸数平均分子量（Mn）=4 090，质量平均分子量（Mw）=4 700熔点为172.8℃，转晶点为88℃，分子量分布（Mw/Mn）=1∶1.14。

ε-聚赖氨酸为淡黄色粉末、水溶性好、吸湿性强、略有苦味，微溶于乙醇，不溶于乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂，不受pH值影响，热稳定性良好，对热（120℃，20 min或100℃，30 min） 稳定，所以可以承受一般食品加工中的热处理。ε-聚赖氨酸带有正电荷，可以与带有阴离子的物质结合。然而，ε-聚赖氨酸遇到磷酸盐类、盐酸盐类、酸性多糖类、铜离子等可能因发生结合而使其活性降低。与甘氨酸、盐酸、醋酸、柠檬酸、苹果酸和高级脂肪酸甘油酯等合用可以增加抑菌效果。对其表征红外光谱分析得出，在 1 680～1 640 cm-1和 1 580～1 520 cm-1处有强吸收峰[3]。

2.2 ε-聚赖氨酸的生物学性质

2.2.1 安全性高

ε-聚赖氨酸是一种具有抑菌作用的多肽，进入人体后可被分解为人体必需的八大氨基酸之一的赖氨酸，所以ε-聚赖氨酸是一种安全性高的营养型抑菌剂，其急性口服毒性为5 g/kg[4]。ε-聚赖氨酸可以广泛应用于食品的生产中，而且在对ε-聚赖氨酸抑菌效果的试验中证实，微量的ε-聚赖氨酸可以起到很好的抑菌效果，所以将ε-聚赖氨酸作为食品防腐剂基本不会影响食品的风味及质地等[5]，而且ε-聚赖氨酸的安全性也已在小鼠试验中得到证实，其并不会对生物体生殖、神经和免疫器官、胚胎和胎儿生长、后代的生长、两代的晶胚和胎儿的发育产生毒副作用，因此完全可以作为一种天然、安全、高效的食品添加剂[6]。

2.2.2 热稳定性

ε-聚赖氨酸热稳定性好，其在80，100，120℃的水溶液环境中分别处理60，30，20 min，均不会分解，不会失去活性，仍具有抑菌能力。试验表明，在对其在高温环境中（120℃）对大肠杆菌的最小抑菌浓度不变[2]。所以，ε-聚赖氨酸能承受得住食品加工过程中一般的热处理环节，可随原料一同进行热处理，由此可以达到防止二次污染的目的。

2.2.3 抑菌谱广

ε-聚赖氨酸抑菌范围广，对于酵母属的尖锐假丝酵母菌、法红酵母菌、产膜毕氏酵母、玫瑰掷孢酵母；革兰氏阳性菌中的耐热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌；革兰氏阴性菌中的产气节杆菌、大肠杆菌等能够引起食物腐败，导致人体食物中毒的菌有显著的抑制作用[7]。

研究也表明[8]，ε-聚赖氨酸对革兰氏阳性的微球菌、保加利亚乳杆菌、热链球菌，革兰氏阴性的大肠杆菌、沙门氏菌和酵母菌的生长可以产生明显的抑制作用,而且聚赖氨酸与醋酸结合所制备的复合试剂对枯草芽胞杆菌的生长有明显的抑制作用。

3 ε-聚赖氨酸的抑菌机理

通过Shima S等人[9]的研究试验，根据电子显微镜发现ε-聚赖氨酸处理后的大肠杆菌K-12细胞形态学表面发生了变化。因为ε-PL具有阳离子特性，这对微生物细胞表面产生了静电吸附作用，在电镜下观察到ε-PL对微生物的膜结构产生了剥夺效果，对细胞质也产生了作用效果使其不再呈现正态分布，这些作用效果最终导致了ε-聚赖氨酸处理作用后的微生物发生了生理性的损害。Shima S等人[9]也发现了含有大于9个L-赖氨酸残基的聚赖氨酸能够严格抑制微生物的生长，并且聚赖氨酸的最小抑菌质量浓度（MIC） 大于100 mg/mL。Vaara M等人[11]的研究试验发现，ε-PL中的α-氨基基团的化学修饰可以降低ε-PL的抑菌活性，在ε-PL对细胞完整性影响的试验中，通过进行观察ε-PL对菌体细胞壁；对菌体细胞膜通透性；对菌体细胞表达蛋白的影响，以及ε-PL对细菌菌体紫外吸收物的渗透检测的试验，初步探究了ε-PL的抑菌机理。ε-PL阳离子表面活性物质可以对微生物细胞外膜产生作用（ε-PL可以显著改变水中的氨基基团，可作为阳离子表面活性剂，可以像其他阳离子聚合物一样对微生物的生长产生抑制作用），从而达到抑制酵母菌、霉菌、革兰氏阳性菌阴性菌等微生物生长繁殖的效果[11]。并且，通过刘蔚等人[10]用ε-PL处理过的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和青霉菌的研究试验，证明ε-PL对微生物的细胞结构、细胞完整性进行了破坏，使其丧失生理作用，而且细胞膜上形成了孔道，致使胞内的大分子物质溢出，胞外离子浓度升高，蛋白质的合成受到了影响，最终导致了细胞的死亡。总的来说，ε-PL的作用机理体现在其作用于细胞壁和细胞膜系统、作用于遗传物质或遗传微粒结构、作用于酶或功能蛋白，逐渐破坏细胞结构，致使细胞死亡。此外，可能由于酵母菌、细菌、霉菌的细胞表面状况不同，ε-PL对它们的最小抑菌浓度（MIC）发生了变化，这需要进一步的研究来进行解释。

3.1 ε-PL对菌体细胞超微结构的影响

通过对ε-PL抑菌机理的研究，刘蔚等人[10]进行了ε-PL对菌体细胞结构影响的试验。选用质量浓度为 400，300，200，100，75，50，25 mg/mL 的ε-PL溶液，以及制备的菌落总数为1×106CFU/mL的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉菌液作为测试菌液。首先测定了ε-PL对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉菌的最小抑菌浓度（MIC）。之后以1倍MIC质量浓度的ε-PL加入菌悬液，用自动酶标仪测得波长630 nm处的吸光度，绘制曲线，应用Hara S等人[12]的计算方法测定其抑菌活力，并用扫描电镜与透射电镜宏观对比ε-PL处理时间对菌体超微结构的影响。

3.1.1 扫描电镜观察

扫描电镜下观察，没有经过ε-PL处理的对照组大肠杆菌细胞表面结构完整、光滑、饱满，没有破损情况，胞内物质没有溢出，且折光性好；经ε-PL作用1 h后的菌体细胞出现了皱缩，部分细胞表面表现出了缢痕，同时在这些区域发生少量原生质向外扩散的现象；随着ε-PL对菌体作用时间的增长，菌体细胞干瘪不饱满，扭曲变形，表面粗糙，破裂塌陷，同时大量胞内原生质外泄[10]。由此试验可知，ε-PL对细胞形态结构产生了破坏作用，从而达到了抑菌效果，而且随着ε-PL对菌体细胞作用时间的增加，菌体细胞受到的损坏越严重，抑菌效果越显著。

3.1.2 透射电镜观察

透射电镜下观察，没有经过ε-PL处理的对照组大肠杆菌菌体细胞壁、细胞膜和核膜完整、光滑，细胞结构紧密，形态饱满，细胞质均匀，细胞核及核仁明显；经ε-PL作用后的菌体，部分菌体细胞开始出现皱缩，胞质不均匀，细胞壁模糊，质壁少部分开始出现分离现象；随着ε-PL对菌体作用时间增加，菌体变形、质壁分离，细胞膜破裂，细胞质固缩，凝集成块，细胞器溶解[10]。

3.2 ε-PL对细胞完整性的影响

通过对ε-PL抑菌机理的研究，在进行了ε-PL对菌体细胞完整性影响的试验中[10]，通过进行观察ε-PL对菌体细胞壁、菌体细胞膜通透性、菌体细胞表达蛋白的影响，以及ε-PL对细菌菌体紫外吸收物的渗透检测的试验，初步探究了ε-PL的抑菌机理。

3.2.1 ε-PL对菌体细胞壁的影响

碱性磷酸酶是出于菌体细胞壁于细胞膜之间的一种酶，在菌体正常生存状态下，胞外检测不到它的活性。当细胞壁遭受破坏，透性增加，碱性磷酸酶可以溢出至胞外。因而可以通过检验细胞外碱性磷酸酶含量的变化确定菌体细胞壁渗透性的变化。细胞壁对微生物细胞的生存有十分重要的作用，而人体细胞没有细胞壁结构，所以微生物的细胞壁结构是达到抑菌效果的最理想的作用目标。菌体细胞壁受到破坏，会导致其细胞抗渗透压能力下降，其他细胞结构受到破坏，甚至死亡。

3.2.2 ε-PL对细胞膜渗透性的影响

ε-PL呈高聚合多价阳离子态[13]，可作为阳离子表面活性剂，像其他阳离子聚合物一样对微生物的生长产生抑制作用，其可以破坏微生物的细胞膜结构，使细胞中断物质、能量和信息的传递，还可以与细胞内的核糖体结合，影响合成生物大分子，最终致使细胞死亡。将微生物置于对其不利的环境，通常其生物膜流动性和半透性降低，会导致细胞质和细胞内K+等电解质的外渗，从而可以通过观察培养液电导率的变化推导出细胞膜渗透性的变化。这些原生质外渗会影响细胞体多种代谢途径，破坏细胞内环境的稳定性，影响多种酶的活性。此外，膜的流动性下降，细胞内外渗透压调节达不到平衡，细胞发生膨胀破裂，最终死亡。

3.2.3 ε-PL对菌体细胞表达蛋白的影响

通过进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[6]发现ε-PL可以抑制菌体的表达蛋白正常代谢，而且作用时间越长，总抑制作用越显著。在ε-PL与菌体作用初期，细胞完整性开始遭受到破坏，最先溢出小分子量蛋白；ε-PL作用时间增加，等到菌体细胞的细胞壁、细胞膜被完全破坏，大分子量蛋白也逐渐溢出，最终细胞内大分子量蛋白缺失[10]。

3.2.4 细菌菌体紫外吸收物的渗透检验

在探究超高压处理对枯草芽孢杆菌超微结构的影响的试验中得出，通常情况下，细菌细胞壁上的微孔只容得小于1 nm的分子通过[14]。由前文所述可知，随着ε-PL对菌体作用时间的增加，菌体细胞的细胞结构受到了破坏，ε-PL在细胞上形成了孔道，这也致使细胞内具有紫外吸收特性的物质溢出到胞外。

4 ε-聚赖氨酸的发酵生产及发酵调控

4.1 ε-聚赖氨酸的合成

合成ε-聚赖氨酸的方法有化学合成法、生物合成法和酶法等方法。其中，目前最为理想的方法为利用白色链霉菌（Streptomyces albulus） 发酵制得ε-聚赖氨酸的方法[15]。

4.2 ε-聚赖氨酸产生菌

通过对多种可产生ε-聚赖氨酸的菌种进行16SrDNA序列分析，这些分离得到的ε-PL的产生菌都属于Streptomyces属或其亲属Kitasatospora[16]。Shima S等人[17]通过Dragendorff试验筛选出的PL-346菌株，根据Shirling和Gottlieb的方法进行分类学鉴定，PL-346属于St.albulus。PL-346菌株在营养琼脂和蛋白胨-酵母膏-琼脂上不产生色素，但在酪氨酸-琼脂上产生黑色素，二氨基庚二酸是其细胞壁产物之一。PL-346生长出的基内菌丝除了在酪氨酸-琼脂和甘油-天冬酰胺-琼脂上为浅黄棕色，其基内菌丝一般为暗黄色。PL的气生菌丝在甘油-天冬酰胺-琼脂、葡萄糖-天冬酰胺-琼脂和燕麦琼脂上生长状况不良，但是在酪氨酸-琼脂和营养琼脂上生长旺盛。气生菌丝成熟形成孢子时呈灰色或浅灰棕色，孢子链呈封闭螺旋排列。

4.3 ε-聚赖氨酸的发酵生产

1981年，Shima S等人[17]已经通过研究发现，在缺乏碳源的培养基中，ε-PL并没有积累下来，所以碳源在ε-PL的发酵生产中是培养基里重要的组成部分，其中最为理想的补充碳源为甘油和葡萄糖。而且单独使用有机氮源并不利于ε-PL的形成，通过硫酸铵和酵母膏的结合使用更有利于ε-PL的产生[3]。在发酵过程中，增加通气量有利于ε-PL的积累，其生产的最适温度为25～30℃。此外，发酵培养过程中的pH值对ε-PL的形成有至关重要的作用。ε-PL形成的最优pH值为4.0，若pH值高于4.0，葡萄糖的消耗速率加快，细胞增长迅速。此外研究表明，白色链霉菌细胞膜表面上有ε-PL降解酶，此酶在pH值大于5.0的环境中才具有活性[18]。所以在pH值低于5.0的酸性环境中，ε-PL降解酶不具有活性，ε-PL可以积累[19]。

4.4 ε-聚赖氨酸的发酵调控

酵母粉含有大量氨基酸、维生素和矿物质，其可以在ε-PL发酵过程中作为活性调控因子调控合成期细胞活性，并产生其他作用，如促进细胞生长、细胞活性增强、增加细胞密度，这有利于ε-PL的生物合成；在ε-PL生物合成过程中维生素和矿物质可分别作为辅酶和激活剂，加快ε-PL的生物合成速率；另外，酵母粉也会增加ε-聚赖氨酸合成酶、促进ε-PL生物合成有关基因的表达，也能改变代谢流向。这些多种促进作用结合起来促进了其生物合成[20]。

5 影响ε-聚赖氨酸抑菌效力的不同因素

5.1 不同热处理对ε-聚赖氨酸抑菌效力的影响

由李树等人[21]研究温度对ε-PL抑菌效力的试验表明，ε-PL热稳定十分好，在25～100℃环境中，ε-PL不分解，不失活，仍具有抑菌活性，且无明显差异。食品加工流程中通常会进行热加工处理，而很多防腐剂会在高温环境下变性、失活，所以ε-PL作为食品防腐剂用于热加工食品中，可与食品共同进行热处理二次灭菌，从而改善抑菌效果。

5.2 不同pH值对ε-聚赖氨酸抑菌效力的影响

ε-PL在较宽的pH值范围下具有抑菌性pH值5～8，其中在pH值为7时，ε-PL抑菌效力最佳，随着酸性或碱性的增加，ε-PL的抑菌效力减弱[21]。

5.3 抑菌功效的比较

5.3.1 ε-聚赖氨酸单独作用抑菌效力

ε-PL质量浓度达到200 mg/L时，对部分微生物的生命活动已经产生了抑制作用，此后随着ε-PL质量浓度的增加，其抑菌效果愈加突出。首先，ε-PL最先对革兰氏阴性大肠杆菌、沙门氏菌等肠道致病菌表现出了显著的抑菌效力；其次，ε-PL对酵母菌等真菌也有抑菌效果；此外，其对呈革兰氏阳性的微球菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌也有抑菌作用[8]。

5.3.2 ε-聚赖氨酸与其他物质结合使用的抑菌效力

ε-PL可对Nisin不能起到抑菌效果的大肠杆菌和酵母菌产生抑菌效果。甘氨酸对细菌有一定的抑制作用，但其并不能抑制酵母菌和霉菌的繁殖，而且单独使用ε-PL作用于枯草芽孢杆菌和黄曲霉并没有较好的抑菌效果，然而将ε-PL和甘氨酸复配，对枯草芽孢杆菌和黄曲霉的抑菌效果明显加强。综上所述并结合李树等人的试验来看，ε-PL和甘氨酸具有很强的协同抑菌效果，并且ε-PL（200 mg/L）、甘氨酸（20 mg/L） 和Nisin（40 mg/L） 复配抑菌效力会进一步加强[21]。ε-PL与醋酸复合作用同样对单独使用ε-PL不能起到很好抑菌效果的枯草芽孢杆菌产生显著的抑制作用。但是ε-PL与醋酸的复合作用对黑曲霉并没有明显的抑菌作用[8]。

6 ε-聚赖氨酸的应用

6.1 ε-聚赖氨酸在食品中的应用

ε-聚赖氨酸是一种生物防腐剂，其也是人体必需氨基酸——赖氨酸的聚合物。由于ε-PL的抗菌性和安全性，添加微量的ε-PL就能达到抑菌的目的，而且不会影响食品的风味，已经广泛应用于食品工业很多领域。在日本，ε-PL已被批准为食品防腐剂，并应用于米饭、面条、鱼类寿司等多种日常烹饪菜品中（ε-PL一般为500 mg/L）；即食菜品ε-PL含量一般为100 mg/L，在寿喜烧、沙拉、乳蛋糕乳脂中也有使用ε-PL[22]。FDA建议ε-PL用于加工食品含量为5～50 mg/L。

6.1.1 肉及肉制品

ε-PL可以延长肉制品的货架期，比如400 mg/L的ε-PL通过抑制微生物的生长繁殖，控制pH值的上升和TVB-N的积累，从而很好地抑制冷鲜猪肉品质的下降[23]。ε-PL、甘氨酸和食用酒精复配对牛肉干的防腐保鲜效果显著，比原牛肉干产品的货架期长，口感品质好[24]。ε-PL应用于广式腊肠也发挥了很好的防腐保鲜效果[25]。综上，ε-PL对肉制品有很好的保鲜防腐效用。

6.1.2 水产类

食品中水产由于其营养成分多且含量高、水分多、pH值接近中性的特点，极易发生腐败变质，其中微生物是最为主要的原因。在3～5℃的环境中，0.1%ε-PL处理3 min南美白对虾可以延长2～3 d的货架期[26]，0.1%ε-PL处理的鱼肉将同样可以延长货架期[27]。

6.1.3 淀粉类食品

面条、米饭、馒头、年糕等均是高淀粉类食物，pH值在中性和弱碱性之间。由之前所述可知，ε-PL不同于大多食品防腐剂的最适抑菌pH值范围为弱酸性，ε-PL在中性、弱碱性和弱酸性均有良好的抑菌效果，所以将ε-PL添加至米饭、湿面条中均达到了很好的抑菌保鲜效果，延长了保质期。张东荣等人[15]研究了ε-PL对米饭保鲜效果，没有经过ε-PL添加的米饭在48 h后颜色泛黄，并伴有恶臭味道；相对比较而言添加了10 mg ε-PL的米饭，颜色和味道都没有明显变化[15]。

6.1.4 其他食品

ε-PL也可用于果汁中，试验证明ε-PL可以很好地抑制脂环酸芽孢杆菌的生长繁殖，严格控制果汁内由脂环酸芽孢杆菌产生的愈创木酚含量，从而延长了果汁货架期的同时还改善了果汁的风味口感[28]。

ε-PL，Nisin、纳他霉素和抗氧化剂茶多酚复配添加至酱腌菜拌料中，可有效延长酱腌菜的保质期至 21 d（37 ℃）[29]。

另外，Kido证明了ε-PL对饭后甘油三酯的抑制作用。ε-PL可作用于含有磷酸胆碱和胆盐的乳剂使其分解，抑制了脂肪酶活性，从而抑制了小肠对脂肪的吸收。所以，ε-PL还被应用于食疗剂中。

6.2 ε-聚赖氨酸在医学方面的应用

由前文所述可知，ε-PL具有高聚合多价阳离子态特性，其可以与有阴离子的物质产生强的静电作用，并且拥有很好的生物膜穿透能力，因此ε-PL可应用于药物载体这一方面。ε-PL与海藻盐复合体制成缓释胶囊，由于ε-PL可以改变海藻酸盐膜的通透性，所以可以达到逐渐释放胶囊内容物的目的，实现膜的缓释功能，以此来达到更好的疗效[30]。例如，解放军总医院基础所的一项科研成果就是用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（APA） 微囊化嗜铬细胞（BCC）注入的脊髓蛛网膜，起到镇痛作用，APA膜也有很好的免疫隔离效果。Hugues J P等人[31]研究发现，把ε-PL与治疗肿瘤、白血病的药物氨甲嘌呤聚合，可以提高药物的疗效[32]。

6.3 ε-聚赖氨酸在生物领域的应用

在研究人表皮细胞时发现ε-PL可以加快表皮细胞贴壁、集落和膜片的形成，并且没有对培养的表皮细胞产生不利影响[32]。刘彦春等人[33]发现，ε-PL不仅对细胞有吸附力ε-PL包埋的支架对软骨细胞吸附能力增强，还发现ε-PL具有促进细胞发挥正常功能，比如促进细胞分泌。

6.4 ε-聚赖氨酸在其他方面的应用

ε-PL可作为高吸性聚合物用于婴儿一次性尿片、妇女卫生巾等工业产品中。目前，市面上所售的ε-PL商品制剂有酒精制剂（通常用于蛋类制品）、醋酸制剂（用于色拉等食品）、甘油制剂（用于含有动物性蛋白乳蛋白的制品）和甘氨酸制剂（质量分数为 0.1%～10.0%）[34-35]。

7 结语

在我国，食品的杀菌防腐保鲜工作一直是以化学和物理手段为主，而日本已经把ε-PL在食品产业中批量化，我国对ε-PL仍处于研究阶段。如今，随着生活水平的日益提高，人们对食品的各方面要求也逐渐提高，越来越多的消费者需求更加健康绿色、营养丰富、多样化、口感风味佳的食品。因此，食品防腐剂具有良好发展前景，ε-聚赖氨酸作为少数对人体无害的天然防腐剂之一，具有很高的研究价值，需要更深入地研究ε-聚赖氨酸并将其很好地应用到食品、医学等领域中，争取早日实现ε-聚赖氨酸的工业化生产，适应市场的需求。