组织培养条件下紫色松乳菇培养条件的优化

王 欢，栾竹青，刘传林，龚雪琴，由翠荣，梁丽琨

（烟台大学生命科学学院，山东烟台 264005）

菌根（Mycorrhiza） 是由真菌和植物根系形成的共生体[1]。侵染植物根系通过长期作用形成菌根的一类真菌称为菌根性真菌。松乳菇（Laclarius deliciosus） 是一种很有开发价值的外生菌根真菌[2]，春、秋季单生或群生于针叶林下，常与松科植物共生形成外生菌根。外生菌根能加强植物对水分和矿质营养元素的吸收，并为植物提供多种植物激素、维生素、脂肪酸等代谢产物，促进植物生长[3-7]。松乳菇子实体含有较多粗脂肪、粗蛋白和人体必需氨基酸，质脆味美，药食两用，具有抗肿瘤和抗菌等功效，深受人们喜爱。但是由于松乳菇子实体发育特定共生关系等因素的影响，目前只能依赖于野生或半人工栽培，而不能人工规模种植，因此具有很大的研究空间[8-9]。为保护和合理开发利用这一珍贵食用菌资源，探索松乳菇的人工栽培技术具有重要意义。

目前，菌根性食用菌的半人工栽培技术逐渐成熟，该技术中如何提高菌根合成率和稳定性是研究重点[10-11]。利用组织培养技术可以在实验室条件下迅速获得大量松树无菌苗，研究组织培养条件下松树无菌苗与菌根性食用菌的共侵染能力和侵染条件，提高菌根合成能力，有望使松乳菇人工栽培成为可能。

植物组织培养的条件一般不利于菌根真菌的生长，因此研究组织培养条件下松乳菇的最适培养基及培养条件是共侵染及菌根合成研究的前提。

试验以改良的1/2MS培养基为基本培养基[12]，采用单因素试验研究组织培养条件下适合松乳菇菌丝生长的最适培养基及培养条件，为松乳菇与黑赤松无菌苗的侵染建立基础。

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

1.1.1 菌种

采集于山东省烟台市昆嵛山的松乳菇子实体，经过组织分离并鉴定保存的纯菌种。

1.1.2 基本培养基

1/2 MS离子[13]，200 g/L土豆，20 g/L葡萄糖，100 mg/L肌醇，100 mg/L酪蛋白，5.5 g/L琼脂，pH值6.0。于115℃下灭菌30 min。

1.2 种子的制备

1.2.1 液体种子的制备

活化于固体基本培养基的菌种，无菌条件在菌落边缘切取边长约0.8 cm的菌丝块8～10块，接种于盛有80 mL基本液体培养基的250 mL锥形瓶中，静置1 d，25℃下以转速120 r/min遮光摇床培养，每隔3 d更换新鲜培养基。连续2次换液后选用直径约2 mm的菌丝球作为液体种子。

1.2.2 固体菌种的制备

活化于固体基本培养基的菌种，无菌操作于菌落边缘切取边长约1.5 cm的菌丝块，接种于固体基本培养基上，每瓶接种4块，于25℃下遮光培养。

1.3 试验方法

1.3.1 液体培养基最适糖源的筛选

分别用20 g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉和乳糖替换基本培养基中的葡萄糖，以10%的接种量接种液体种子，每组处理5个平行，3次重复试验。于25℃下，以转速120 r/min摇床遮光培养14 d，测定菌丝球的干质量。

1.3.2 液体培养基最适糖源质量浓度的筛选

以5种糖类质量浓度（10，15，20，25，30 g/L）分别替换基本培养基中的葡萄糖质量浓度，以10%的接种量接种液体种子，每组处理5个平行，3次重复试验。于25℃下，以转速120 r/min摇床遮光培养14 d，测定菌丝干质量。

1.3.3 液体培养基最适接种量的筛选

分别以接种量6%，8%，10%，12%，14%接种液体种子于液体基本培养基中，每组处理5个平行，3次重复试验。于25℃下，以转速120 r/min摇床遮光培养14 d，测定菌丝干质量。

1.3.4 液体培养基最适装液量的筛选

分别以5种装液量70，75，80，85，90 mL将基本培养基分别装于250 mL的锥形瓶中，以10%的接种量接种液体种子，每组处理5个平行，3次重复试验。于25℃下，以转速120 r/min摇床遮光培养14 d，测定菌丝干质量。

1.3.5 最适液体培养条件下生长曲线的测定

以最适接种量接种液体种子于优化的液体培养基中，于25℃下，以转速120 r/min摇床遮光培养16 d，每天取3瓶测定菌丝干质量，以培养时间为横坐标，菌丝干质量为纵坐标绘制曲线。

1.3.6 固体培养基最适糖源的筛选

分别用20 g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉和乳糖替换基本培养基中的葡萄糖，用无菌打孔器切取固体种子的边缘位置接种固体基本培养基，每瓶接种1块，每组处理5个平行，3次重复试验。于25℃下遮光培养14 d，采用垂直交叉法测量菌落直径，并观察菌丝生长情况。

1.3.7 固体培养基最适糖源质量浓度的筛选

分别以质量浓度10，15，20，25，30 g/L替换基本培养基中的葡萄糖质量浓度，用无菌打孔器切取固体种子的边缘位置接种固体基本培养基，每瓶接种1块，每组处理5个平行，3次重复试验。于25℃下遮光培养14 d，采用垂直交叉法测量菌落直径，并观察菌丝生长情况。

1.3.8 最适固体培养条件下生长曲线的测定

用无菌打孔器切取固体种子的边缘位置接种优化的固体培养基，每瓶接种1块，于25℃下遮光培养16 d。每天测量菌落直径，以培养时间为横坐标、菌落直径日增长量为纵坐标绘制曲线。

2 结果与分析

2.1 糖源种类对松乳菇液体培养的影响

分别用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉和乳糖替换基本培养基中的葡萄糖，于25℃下以转速120 r/min摇床遮光培养14 d，测量菌丝干质量。

使用不同糖源松乳菇液体培养的菌丝干质量见图1。

图1 使用不同糖源松乳菇液体培养的菌丝干质量

从图1可看出，在其他条件相同的情况下，紫色松乳菇对5种糖类都可利用，但利用程度不同。在含葡萄糖的培养基中，菌丝生长旺盛、菌丝球洁白，菌丝干质量达0.68 g，约为其他糖类的2倍，因此葡萄糖最适合松乳菇液体培养。其次是麦芽糖，菌丝球密度较大、生长良好；可溶性淀粉不易分解难以直接利用，且易产生沉淀；紫色松乳菇利用率最低的是乳糖，菌丝球密度较低、菌丝干质量仅0.27 g。

周国英等人[14]对松乳菇菌丝深层液体培养营养因子及培养条件的研究表明，最适碳源为葡萄糖，硫酸镁和氯化钠可以加速启动生长，磷酸二氢钾使菌丝产量提高。周传云等人[15]对松乳菇液态培养工艺及其饮料配方的研究表明，最佳培养基配方各添加量为麸皮汁4%，葡萄糖4%，蔗糖3%，马铃薯汁25%，米糠汁5%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.15%。

2.2 糖源质量浓度对松乳菇液体培养影响

分别用质量浓度10，15，20，25，30 g/L替换基本培养基中葡萄糖，于25℃下以转速120 r/min摇床遮光培养14 d，测量菌丝干质量。

不同糖源质量浓度松乳菇液体培养的菌丝干质量见图2。

图2 不同糖源质量浓度松乳菇液体培养的菌丝干质量

由图2可知，不同糖源质量浓度对松乳菇液体培养菌丝生物量有影响。糖源质量浓度过低不能满足菌丝生长的需求造成菌丝生长缓慢；而糖源质量浓度过高则会导致培养液黏稠度增大、降低溶解氧浓度，不利菌丝生长。在以葡萄糖为糖源的培养基中，松乳菇菌丝生物量随着葡萄糖质量浓度的增加呈先增后降的趋势，在25 g/L时达到最大值。

2.3 松乳菇液体培养的最适接种量

分别以6%，8%，10%，12%，14%接种量接种液体种子于液体基本培养基中，25℃下以转速120 r/min摇床遮光培养14 d，测量菌丝干质量。

不同接种量松乳菇液体培养的菌丝干质量见图3。

图3 不同接种量松乳菇液体培养的菌丝干质量

适宜的接种量可使菌种利用营养物质快速生长，获得大量的菌丝球。接种量过低，菌丝生长缓慢，在生长周期内无法获得期望的生物量；接种量过高，定量的营养物质无法满足菌丝的生长要求，菌丝产生的代谢废物大量积累，也会对菌丝的生长造成威胁。从图3可看出，接种量为12%时，菌丝干质量达到最大值。

2.4 松乳菇液体培养基的最适装液量

分别用70，75，80，85，90 mL替换基本培养基中的装液量，于25℃下以转速120 r/min摇床遮光培养14 d，测量菌丝干质量。

不同装液量松乳菇液体培养的菌丝干质量见图4。

图4 不同装液量松乳菇液体培养的菌丝干质量

装液量对菌丝的生长有一定影响。装液量过少，每次获得的菌丝生物量也少，并且随着培养天数的增加，培养液易变黏稠；装液量过多，无法满足菌丝生长所需要的供氧量，不利于菌丝的生长。从图4可看出，随着装液量的增加，菌丝干质量也在增加，在装液量为90 mL时达到最大值。

2.5 松乳菇在最适液体培养条件下的生长

以12%的接种量接种液体种子于优化的液体培养基中，以培养时间为横坐标，菌丝干质量为纵坐标绘制曲线。

松乳菇在最适液体培养条件下的生长曲线见图5。

图5 松乳菇在最适液体培养条件下的生长曲线

从图5可看出，松乳菇液体种子接种到优化的液体培养基后，先开始一段延滞期，这一时期菌丝适应新生长环境，合成生长所需要的各种酶或辅酶等；从5 d开始进入快速生长期，这一时期，营养物质充足、代谢旺盛、外部环境稳定、菌丝生长量达最大值；之后进入稳定期，菌丝干质量趋于稳定，这一时期一般4 d左右；稳定期过后进入衰亡期，因为外部环境的变化和代谢废物的积累造成菌体老化、自溶，菌丝球由白色变为黄色、菌丝生物量下降、培养液变浑浊。

2.6 糖源种类对松乳菇固体培养影响

分别用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉和乳糖替换基本培养基中的葡萄糖，25℃下遮光培养14 d，测量菌落直径。

糖源种类对松乳菇固体培养的影响见图6，不同糖源对松乳菇菌丝生长的影响见图7。

图6 糖源种类对松乳菇固体培养的影响

图7 不同糖源对松乳菇菌丝生长的影响

不同种类糖源对松乳菇固体培养的菌丝生长存在显著影响。从图6可看出，在以葡萄糖为糖源的培养基中菌落直径最大，生长速度最快；其次是蔗糖和麦芽糖；菌落直径最小的糖源为乳糖。从图7可看出，在葡萄糖为糖源的培养基中菌丝最为浓密、菌丝生长快速呈白色；其次是可溶性淀粉和麦芽糖，菌丝生长较浓密，部分呈黄色；在含蔗糖和乳糖的培养基中菌丝生长稀疏。

李忠海等人[16]对松乳菇固体培养的研究表明，松乳菇菌丝生长的最适培养基是PDA培养，无光照培养。杜丽飞等人[17]对松乳菇菌种分离及菌丝生长特性的研究表明，最适碳源为葡萄糖，最适氮源为乙酸铵，其次是玉米浆和蛋白胨。

2.7 糖源质量浓度对松乳菇固体培养的影响

分别用质量浓度10，15，20，25，30 g/L替换基本培养基中的葡萄糖，测量菌落直径。

不同糖源质量浓度对松乳菇丝生长的影响见图8，不同糖源质量浓度对松乳菇菌丝生长的影响见图9。

从图8可看出，在一定浓度范围内的糖源质量浓度对菌丝的生长有促进作用，但质量浓度过高或过低都会抑制菌丝生长。在质量浓度25 g/L葡萄糖的培养基中，菌丝生长速度最快，菌落直径最大。

从图9可看出，在糖源质量浓度为25 g/L时，菌丝最为浓密，活力旺盛呈白色；其次为20 g/L和15 g/L，菌丝较密，菌落中部呈黄色出现老化现象。

2.8 松乳菇固体培养的生长曲线

图8 不同糖源质量浓度对松乳菇丝生长的影响

图9 不同糖源质量浓度对松乳菇菌丝生长的影响

接种固体种子于优化的固体培养基上，每天测量菌落直径，以培养时间为横坐标、菌落直径日增长量为纵坐标绘制曲线。

松乳菇在最适固体培养条件下的生长曲线见图10。

图10 松乳菇在最适固体培养条件下的生长曲线

从松乳菇固体培养的生长曲线可看出，将生长良好菌丝活力旺盛的固体种子接入优化的培养基中，首先需要适应新生长环境，菌丝生长缓慢；从6 d开始进入快速生长期，这一时期约维持2 d，8 d菌落直径日增长量达最大值；之后，菌丝增长速度开始下降，菌丝开始褐化衰老。