高效液相色谱法同时测定舒筋活血片中5种成分

郭 娅，王文婷，袁 林

（重庆市万州食品药品检验所，重庆 404000）

舒筋活血片是由红花、醋香附、香加皮、狗脊和槲寄生等10味中药组方的中药制剂，可用于筋骨疼痛、活血散瘀［1-5］，收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂（第十三册）》［6］。现行标准中舒筋活血片的含量检测以4-甲氧基水杨醛为指标成分，仅检测香加皮中有效成分的含量，但单一成分的检测不能完整、充分地反映和体现药物的内在质量。目前，关于测定舒筋活血片中其他成分含量的研究已有报道［7-14］。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定舒筋活血片中4-甲氧基水杨醛、α-香附酮、原儿茶酸、羟基红花黄色素A和山柰素5种成分的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（安捷伦公司），包括紫外检测器；AB204S型分析天平（万分之一，梅特勒公司），MSE225S型分析天平（十万分之一，赛多利斯公司）。

1.2 试药

4-甲氧基水杨醛对照品（批号为110790-201404，纯度为99.0%），α-香附酮对照品（批号为110709-201111，纯度为 99.3% ），原儿茶酸对照品（批号为110810-201007，纯度为 98.2%），羟基红花黄色素 A对照品（批号为 111637-201308，纯度为 96.5%），山柰素对照品（批号为 110861-201301，纯度为 93.2%），均购自中国食品药品检定研究院；舒筋活血片（重庆天致药业股份有限公司，批号为180401；河南省百泉制药有限公司，批号为171125；三门峡广宇生物制药有限公司，批号为201802）；甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.7%醋酸溶液（A）- 甲醇（B），梯度洗脱（0～13 min，30%A，70%B；13～25 min，30%A→80%A，70%B→20%B；25～40 min，80%A，20%B）；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL ／min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

取4-甲氧基水杨醛、α-香附酮、原儿茶酸、羟基红花黄色素A和山柰素对照品，精密称定，加70%甲醇制 成质量浓度分 别为 239.4，527.2，268.2，292.6，103.6 μg／mL的对照品贮备溶液。分别精密量取上述贮备溶液各2.0 mL置同一25 mL容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。取样品20片，研细，混匀，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率为500 W，频率为 40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。取缺少香加皮、香附、狗脊和红花的阴性样品，按供试品溶液项下方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别吸取2.2项下3种溶液各适量，精密称定，按拟订色谱条件进样分析。色谱图见图1。可见，5种被测成分分离完全，阴性对照无干扰，专属性良好。

线性关系考察：分别精密量取2.2项下5种对照品贮备溶液 0.2，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，10.0 mL，置 25 mL容量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列混合对照溶液。按拟订色谱条件进样，以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

精密度试验：按拟订色谱条件，取混合对照品溶液连续进样6次，记录峰面积。结果4-甲氧基水杨醛、α-香附酮、原儿茶酸、羟基红花黄色素A和山柰素的RSD分别为 0.06% ，0.10% ，0.22% ，0.69% ，0.35%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液（批号为180401），分别于 0，2，4，8，12，24 h 时进样，记录峰面积。结果 4-甲氧基水杨醛、α-香附酮、原儿茶酸、羟基红花黄色素A 和山柰素的RSD分别为 0.56% ，1.27%，0.98%，0.99%，1.08%（n＝6），表明供试品溶液中 5 种成分在70%甲醇中24 h内稳定。

图1 高效液相色谱图

表1 5种成分线性回归方程和线性范围

重复性试验：平行制备供试品溶液6份，进样，记录峰面积。结果4-甲氧基水杨醛、α-香附酮、原儿茶酸、羟基红花黄色素A和山柰素的RSD分别为0.92%，2.19%，1.64%，0.64% ，0.91% （n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为180401）6份，每份约1.0 g，精密称定，分别按样品含量-对照品（1∶1）的比例加入一定量的对照品溶液，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定，计算回收率。结果见表2。

2.4 样品含量测定

取3批样品各约2.0 g，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析，以外标法计算含量。结果见表3。

3 讨论

3.1 提取条件优化

通过单因素试验考察，对提取溶剂（甲醇、70%甲醇和50%甲醇）、提取方法（超声、回流）和提取时间（20，30，40 min）进行比较，结果表明，用70%甲醇超声处理30 min为最优提取条件。

表2 加样回收试验结果（n＝6）

表3 3批样品含量测定结果（mg／g，n＝3）

3.2 色谱条件优化

曾比较检测波长（254，300，360 nm）、0.7% 醋酸溶液 -甲醇比例（10 ∶90，20 ∶80，30 ∶70）、不同比例的醋酸溶液（0.2% ，0.5% ，0.7% ）对试验的影响，结果表明，当检测波长为254 nm，醋酸溶液体积分数为0.7%，且与甲醇比例为30∶70时，色谱峰峰形和分离度最佳。

3.3 研究价值

舒筋活血片目前尚未列入2015年版《中国药典》，现行标准为国家药品标准WS3-B-2624-97-2011。其含量检测中以4-甲氧基水杨醛为指标成分，仅检测香加皮中有效成分的含量，但单一成分的检测不能完整、充分地反映和体现药物的质量，本研究中以舒筋活血片为对象，采用HPLC法同时测定其中4-甲氧基水杨醛、α-香附酮、原儿茶酸、羟基红花黄色素A和山柰素5种成分的含量。结果表明，各成分在40 min内检测完全，方法精密度、重复性、准确度均良好，可用于检测不同批次的样品，对舒筋活血片的多成分含量测定和质量控制提供了参考。