miR-127在肺癌中的表达及功能

李建波，江文凛，樊汉利

0 引言

肺癌的发病率及死亡率在所有恶性肿瘤中排名第一[1]，目前我国肺癌发病率及死亡率呈逐年升高趋势，严重威胁国民健康[2]。早期肺癌的治疗仍以手术为主，但对于晚期肺癌患者，五年生存率仅有大约4%。因此对肺癌的早期诊断和治疗显得尤为重要。目前越来越多的证据证明非编码RNA，如mircoRNA，靶向作用于目标基因mRNA，引发目标mRNA的降解，从而调节致癌基因和抑癌基因的蛋白表达[3-5]。很多研究显示，miRNA参与肺癌增殖、侵袭和转移的调控[6-8]。

人类miR-127基因位于染色体14q32.31的一个包括miR-136、miR-431、miR-432、miR-433、miR-337和miR-665的miRNA族，位于Dlk/Gtl2的印迹区域，反方向转录为Rtl1基因。人类miR-127基因前体可以表达两个成熟的miRNA，miR-127-3p和miR-127-5p[9]。近年来有学者开始研究miR-127在肿瘤中的作用，如Bier等[10]的研究表明miR-127在神经胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌和结肠癌中表达下调。Chen等[11]发现胃癌细胞系miR-127高表达后抑制细胞增殖、细胞周期进程、细胞的迁移和侵袭。吴新华等[12]研究发现宫颈癌miR-127低表达，宫颈癌组织miR-127表达检测有助于预测淋巴结转移情况和患者预后。然而miR-127在肺癌中的作用还未见报道，因此本文旨在研究miR-127在肺癌中的表达及其对肺癌细胞生物学特性的影响。

1 资料与方法

1.1 组织标本与细胞

本次研究组织标本来自华中科技大学同济医学院附属武汉市普爱医院2012年1月至2018年1月的20例肺癌患者的癌组织及其相应癌旁组织，其中男12例、女8例，年龄43~78岁（62.3±7.45）岁，其中腺癌7例、 鳞癌 13例；病理分期为Ⅰ期7例、Ⅱ期5例、Ⅲ期4例、Ⅳ期4例。肺癌细胞株A549购自中国科学院上海细胞库，采用DMEM培养基培养（购自美国Hyclone公司），胎牛血清购自美国Gibco公司。

1.2 实时荧光定量PCR测定各组miR-127含量

采用试剂盒提取肺癌组及癌旁组织组中的总RNA，用实时荧光定量PCR法测定各组miR-127表达量，内参使用GAPDH进行标准化。

1.3 肺癌细胞株转染实验

对数生长期的A549细胞接种于6孔板，待细胞密度融合为60%~70%时将细胞分为两组：miR-127 mimics组及空白载体转染组（negative control, NC），分别进行miR-127 mimics及空白载体转染，细胞转染用Lipofectamine2000，具体步骤参照转染试剂说明书。转染后48 h收集细胞内RNA检测miR-127表达水平。

1.4 细胞克隆形成实验

取miR-127 mimics及NC组的A549细胞，以1000个/孔接种于6孔板，细胞培养箱温育1~3周，待细胞克隆形成，使用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫对细胞群落进行染色，计集落数。

1.5 MTT法检测A549细胞增殖活性

取miR-127 mimics及空白载体转染的A549细胞，以3 000个/孔接种于96孔板培养，实验结束前4 h加入5 mg/ml的MTT 20 μl，继续培养4 h后弃培养液，各孔加入DMSO 150 μl，室温振荡10 min，于酶标仪490 nm 波长处测定吸光度（OD）值。

1.6 Transwell实验检测肿瘤细胞侵袭

将Transwell小室置于24孔板后，加入miR-127 mimics和空白载体转染组细胞，小室内加入200 ml无血清培养基，24孔板内加入600 ml血清培养基。培养24 h后取出Transwell小室，擦除未通过小室滤膜的细胞，采用0.1%结晶紫对迁移细胞进行染色、漂洗、固定，任取镜下5个视野进行计数，每组实验重复3次观察其迁移情况。

1.7 统计学方法

采用SPSS22.0软件对数据进行统计分析，研究资料数据服从正态分布，各组数值用均数±标准差（±s）表示。两组比较采用t检验。方法，多组比较使用方差分析，组内两两比较使用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-127在肺癌及癌旁组织中的表达

miR-127在肺癌组织（0.55±0.05）中的表达水平显著低于癌旁组织（1.45±0.13），差异有统计学意义（P=0.001），提示miR-127可能与肺癌的发生发展相关，见图1。

图1 miR-127在肺癌组织及癌旁组织中的表达Figure1 Expression of miR-127 in lung cancer tissues and adjacent normal tissues

2.2 miR-127的表达与肺癌病理分期的关系

病理分期为Ⅰ期的miR-127的表达处于较高水平，Ⅱ期、Ⅲ期肺癌组织的miR-127表达相对低分期组而言表达较低，Ⅳ期肺癌组织表达水平最低，统计分析显示miR-127的表达水平与病理分期呈正相关（H=6.528, P=0.034），见图2。

2.3 miR-127 mimics转染A549细胞

图2 miR-127的表达与肺癌病理分期的关系Figure2 Relationship between miR-127 expression and pathological stage of lung cancer

将miR-127 mimics组、NC组进行转染，培养48 h后提取RNA检测，miR-127的表达水平结果显示miR-127 mimics组显著高于NC组（P=0.0001），见图3。

图3 miR-127 mimics转染A549细胞后miR-127的表达水平Figure3 Expression of miR-127 in A549 cells after miR-127 mimics transfection

2.4 MTT法检测miR-127对A549细胞增殖的影响

miR-127 mimics转染后48 h，用MTT法检测A549细胞miR-127 mimics组和NC组中肺癌细胞的增殖，结果显示miR-127 mimics转染显著抑制肺癌细胞的增殖，差异有统计学意义（P=0.0045），见图4。此外，平板克隆形成实验表明，与NC组相比，miR-127 mimics组中的肺癌细胞A549的集落形成效率显著降低，见图5。

图4 MTT法检测miR-127对A549细胞的增殖Figure4 Proliferation of A549 cells after miR-127 mimics transfection detected by MTT assay

2.5 Transwell实验检测miR-127对肺癌A549细胞迁移能力的影响

采用Transwell实验观察miR-127 mimics组和NC组肺癌A549细胞的过膜数量，miR-127 mimics组（79±18个/视野）明显低于NC组（352±21个/视野），差异有统计学意义（P=0.002），见图6。

3 讨论

图5 平板克隆形成实验检测肺癌细胞A549的集落形成情况Figure5 Colony formation of A549 cells detected by cell colony formation assay

图6 Transwell实验检测miR-127 mimics转染A549细胞的迁移能力Figure6 Migration ability of A549 cells after miR-127 mimics transfection detected by Transwell assay

肺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，其临床死亡率呈逐年上升趋势[1]。早期肺癌的治疗仍以手术切除为主，但由于肺癌早期症状不明显，大多患者就诊时已属中晚期，且因肿瘤细胞局部浸润和远端转移，患者失去根治性手术的机会，而且高复发率也是造成肺癌预后不理想的原因之一[13]。因此，早期诊断和治疗是保障肺癌患者良好预后的关键因素。寻找肺癌早期诊断标志物对及时诊治肺癌具有重要意义。近年来microRNA以其在生物学过程中多样化的调节作用而备受关注[14-15]。各种肿瘤异常的microRNA表达谱为我们研究肿瘤发生提供了新的思路。

miR-127作为mircoRNA中的一员，其在多种肿瘤的发生发展中起到主要的作用。miR-127最早在胃癌、恶性胶质瘤、乳腺癌中发现，后来逐渐发现miR-127在卵巢癌、恶性胶质瘤、肺癌、直肠癌及神经胶质瘤中起到肿瘤抑制的作用[9-12]，然而miR-127在肺癌的发生发展中究竟起着什么样的作用，尚不清楚。本研究收集肺癌及癌旁组织标本，并提取标本的miR-127表达量进行分析，结果发现miR-127在肺癌组织中表达量明显低于癌旁正常组织，差异有统计学意义。对收集到的肺癌组织以病理分级进行分组，比较不同病理分级的肺癌组织中miR-127的表达情况，研究发现在肺癌组织中miR-127的表达量随着病理分级的恶性程度的增高而降低， Ⅳ期中miR-127表达量最低。miR-127在不同病理级别的肺癌组织中的表达差异有统计学意义，提示miR-127的表达可能与肺癌的发生发展相关。基于以上研究结果，我们成功使用miR-127 mimics转染A549细胞株，并进一步对转染细胞进行了MTT、克隆形成实验及Transwell实验。MTT实验结果显示miR-127 mimics转染显著抑制肺癌细胞的增殖，克隆形成实验表明，与NC组相比， miR-127 mimics组中的肺癌细胞A549的集落形成效率显着降低。Transwell实验结果显示与NC组相比，miR-127 mimics组的细胞过膜数量减少，差异有统计学意义。Transwell实验结果验证了miR-127的表达水平与肺癌细胞的迁移能力相关，miR-127的表达量增多可以抑制肺癌细胞的增殖迁移能力。综上所述，肺癌组织中miR-127的表达水平较正常组织低，随着病理分级恶性程度的增高而降低，并且过表达miR-127以抑制肺癌细胞的增殖转移，提示miR-127对肺癌的发生发展发挥重要作用，并且与肺癌的增殖转移密切相关，可作为肺癌的潜在临床诊治靶点，测定miR-127的表达量可以为早期诊断和治疗肺癌提供新思路。