TAK-242对人多发性骨髓瘤细胞增殖及凋亡的影响

段萍萍，艾丽梅

0 引言

多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）以骨髓浆细胞的恶性增生为特征，是血液系统的恶性肿瘤，发病率仅次于淋巴瘤，在我国的发病率约为1/10万[1]。传统的多发性骨髓瘤治疗。方法包括化疗、放疗以及造血干细胞移植，但治疗效果不理想。多发性骨髓瘤到目前为止依然被认为是一种不可治愈的疾病[2]，对大多数骨髓瘤患者的治疗目的是改善其生活质量、延长生存期。有临床研究表明：生物治疗对多发性骨髓瘤具有良好的疗效[3-4]。因此，寻找多发性骨髓瘤生物治疗的潜在靶点，已经成为目前血液系统恶性肿瘤研究的热点。

Toll样受体4（Toll like receptors 4, TL R4）是一种模式识别受体，属于Ⅰ型跨膜蛋白[5]，是人类发现的第1个TLR样相关蛋白，分布于多种组织和细胞中。研究表明，TLR4通过对入侵的病原相关分子模式（pathogenassociated molecular patterns, PAMP）或损伤相关分子模式（damage- associated molecular patterns,DAMP）的识别，从而启动机体的固有免疫和获得性免疫[6]。 TLR4在炎性反应、免疫和肿瘤的发生发展中具有重要的影响，能够激活Myd88/NF-κB信号通路、诱导肿瘤细胞的免疫逃逸、促进肿瘤细胞的增殖和恶化、抑制肿瘤细胞的凋亡，提示TLR4可能会成为肿瘤生物治疗的新靶点。因此，本研究观察了TLR4抑制剂TAK-242对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226 增殖、凋亡的影响，并探究可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226由中国医学科学院血液病医院实验室赠予。反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自加拿大ABM公司。引物合成及测序均由上海生物工程科技有限公司完成，见表1。Myd88、NF-κB、GAPDH抗体购自英国Abcam公司，TAK-242购自法国InvivoGen公司，RPMI1640培养液购自美国HyClone公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所，Annexin-V/PI试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司。

表1 PCR引物序列Table1 Sequences of PCR primers

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞株复苏后接种于培养瓶中，采用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养液（青霉素100 u/ml和链霉素100 μg/ml），于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每2~3天换液或传代，取对数生长期细胞进行实验。将RPMI8226细胞分为A、B、C组及对照组（control），其中A、B、C组分别加入终浓度为20、40、80 μmol/L的TAK-242培养（浓度选择参考文献[7]）, 对照组不加抑制剂。

1.2.2 CCK-8法检测各组细胞增殖抑制率 取对数生长期RPMI8226细胞接种于96孔板，每孔6×103个细胞，每组设4个平行孔，按照上述。方法分为4组，于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养24 h，培养结束前4 h每孔加入10 μl CCK-8。用自动酶联免疫检测仪检测各孔细胞在450 nm波长处的吸光度值（OD值），根据吸光度值分析细胞的增殖能力。细胞增殖抑制率=（1-OD实验组/OD对照组值）× 100%，实验重复3次，取平均值。

1.2.3 Annexin-V/PI检测各组细胞凋亡率 取对数生长期RPMI8226细胞接种于6孔板，每孔4×105个细胞，按照上述。方法分为4组，放置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养，24 h后取各组细胞，用预冷PBS洗涤2次，收集细胞后加入100 μl 1×Binding Buffer重悬细胞，然后加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI Staining Solution并轻轻混匀，室温、避光条件下反应15 min 。加入400 μl 5×Binding Buffer混匀后用流式检测专用的试管收集标本，用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。

1.2.4 RT-PCR检测各组细胞TLR4、Myd88 mRNA表达水平 采用1.2.3中的。方法收集细胞，用TRIzol法提取细胞总RNA，然后用NanoDrop ND-2000超微量分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。根据ABM反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。采用20 μl RT-PCR反应体系，反应条件为：25℃ 10 min, 42℃ 50 min, 85℃ 5 min。按照ABM说明书，配制qPCR反应体系20 μl，反应条件如下：95℃预变性10 min×1；95℃变性15 s，60℃退火60 s，共40个循环。实验重复3次，2-ΔΔCt法计算TLR4、Myd88 mRNA的相对表达水平。

1.2.5 Western blot检测细胞Myd88、NF-κB的蛋白表达情况 同样的。方法收集细胞后用RIPA裂解液在冰上裂解20 min，4℃ 、12 000 r/min离心10 min后取含全蛋白的上清液，用BCA法进行蛋白定量。然后上样、电泳、转膜，采用5%BSA室温封闭2 h，TBST洗膜5 min×3次，加入Myd88、NF-κB、GAPDH的一抗（稀释比例均为1:1 000），4℃孵育过夜，TBST洗膜3遍，每次10 min。再加入二抗室温下杂交1.5 h，TBST洗膜3遍，每次10 min，应用ECL显色剂显影并保存，用Image J软件分析条带的灰度值，计算条带Myd88、NF-κB与GAPDH条带的灰度值之比。

1.3 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差（±s）表示，多组间的检验先采用单因素方差分析，若整体差异有统计学意义，进一步多重比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Toll样受体4抑制剂TAK-242对细胞RPMI8226增殖抑制率的影响

CCK-8结果显示，与对照组（0）比较，A、B、C三组多发性骨髓瘤细胞增殖抑制率逐渐升高，分别为（27.76±3.85）%、（47.50±2.78）%、（73.43±1.69）%，差异均有统计学意义（P=0.000）。提示TLR4抑制剂具有抑制RPMI8226细胞增殖的作用，见图1。

图1 CCK-8法检测不同浓度抑制剂对人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖的抑制作用Figurel Inhibition effect of TAK-242 at different concentrations on proliferation of human multiple myeloma cell lines RPMI8226 detected by CCK-8 assay

2.2 Toll样受体4抑制剂TAK-242对细胞RPMI8226凋亡率的影响

流式细胞术检测结果显示，经不同浓度的抑制剂处理RPMI8226细胞24 h后，随着抑制作用浓度的增加，多发性骨髓瘤细胞凋亡率逐渐升高，分别为A组（34.67±5.03）%、B组（42.33±2.52）%、C组（55.67±5.13）%，各浓度组与对照组（19.67±2.52）%之间的凋亡率差异有统计学意义（P=0.000）。提示TLR4抑制剂具有促进RPMI8226细胞凋亡的作用，见图2。

2.3 Toll样受体4抑制剂TAK-242对RPMI8226细胞TLR4、Myd88 mRNA表达水平的影响

结果显示，经不同浓度的抑制剂处理RPMI8226细胞24 h后，随着抑制作用浓度的增加，TLR4、Myd88 mRNA相对表达量逐渐降低，各浓度组与对照组之间的差异有统计学意义（P<0.05）。其中，C组TLR4、Myd88 mRNA相对表达量明显降低（P=0.049、P=0.014），A组、B组TLR4、Myd88 mRNA相对表达量显著降低（P=0.000），见图3。

2.4 Toll样受体4抑制剂TAK-242对RPMI8226细胞Myd88、NF-κB的蛋白表达的影响

Western blot结果显示，经不同浓度的抑制剂处理RPMI8226细胞24 h后，随着抑制作用浓度的增加，Myd88、NF-κB的蛋白相对表达量逐渐降低，各浓度组与对照组之间的差异有统计学意义（P<0.05）。其中，B组Myd88蛋白相对表达量（P=0.000）、C组NF-κB的蛋白相对表达量（P=0.002）显著降低，见图4。

3 讨论

图2 流式细胞术检测不同浓度抑制剂作用24h后人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226的凋亡率Figure2 Apoptosis rate of human multiple myeloma cell lines RPMI8226 after 24h of TAK-242 treatment at different concentrations detected by fl ow cytometry

图3 RT-PCR检测不同浓度抑制剂作用后人多发性骨髓瘤细胞TLR4、Myd88 mRNA的表达水平Figure3 TLR4 and Myd88 mRNA expression in human multiple myeloma cells treated with different concentrations of TAK-242 detected by RT-PCR

图4 Western blot检测不同浓度抑制剂作用后人多发性骨髓瘤细胞Myd88、NF-κB的蛋白表达情况Figure4 Expression of Myd88 and NF-κB in human multiple myeloma cells treated with different concentrations of TAK-242 detected by Western blot

TLR4是人类发现的第一个跨膜信号转导受体家族（TLRs）相关性蛋白，在TLRs中占有重要位置，其结构分为3部分：胞内段、跨膜区、胞外段，可以调控共刺激信号分子和细胞因子的表达，也可以调控细胞的增殖、凋亡以及肿瘤微环境的形成。TLR4信号通路有两条：一条为Myd88依赖性信号途径，另一条为Myd88非依赖性转导途径[8]，其中以Myd88依赖性转导途径最为常见。髓样分化因子88（myeloid differentiation factor88,Myd88）是一种含有TIR结构域的接头蛋白，被认为是TLR4信号转导过程中最重要的接头蛋白。它的本质是一种细胞质可溶性蛋白，是Toll样信号通路中最关键的衔接分子[9]。Myd88依赖性信号途径通过激活Myd88，最终开启MAPK和NF-κB信号通路，以及促炎性反应因子、共刺激分子的表达；Myd88非依赖性信号途径则不依赖于Myd88蛋白的激活，主要是通过干扰素调节因子3（IFN regulatory factor 3, IRF-3）来延迟性激活NF-κB的活性。TLR4信号通路在肝癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等肿瘤细胞中的作用被广泛报道[10-13]，而在多发性骨髓瘤中的表达和意义及其作用机制较少有文献报道。

TLR4是近些年肿瘤免疫学领域的研究热点，靶向TLR4的小分子特异性抑制剂有望成为肿瘤治疗的新药[14]。TAK-242是TLR4胞内结构域的选择性特异性抑制剂[15-16]，目前已经证实了其在体外细胞培养实验中具有抗肿瘤的作用[17]，但是对于其在多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡中的作用目前尚无相关报道。

为了明确TLR4信号通路在多发性骨髓瘤进展中的作用，本研究经不同浓度的TLR4抑制剂处理多发性骨髓瘤RPMI8226细胞，结果显示，实验组细胞TLR4、Myd88 mRNA表达水平降低，同时Myd88、NF-κB蛋白表达量也降低，提示通过抑制TLR4信号通路可以显著抑制NF-κB的表达水平，与2016年Gao等[18]的报道相似。NF-κB是一种氧化还原敏感蛋白复合物，是调节炎性反应过程的关键转录因子，在炎性和免疫反应中起重要作用。在正常情况下，通常NF-κB以与p50、p65结合形成异二聚体的形式存在，并且与NF-κB抑制蛋白（inhibitor proteins of NF-κB, IκB）结合形成三聚体，滞留在细胞质中，TLR4信号通路被激活后，IκB发生磷酸化，进而和NF-κB解离，三聚体被降解，NF-κB由此活化后迁移进入细胞核内，活化并启动包括TNF-α、IL-1β、IL-6在内的多种炎性反应介质的表达，完成信号通路转导，然而炎性细胞因子的产生会反过来激活NF-κB，炎性反应被放大，由此引发炎性反应的级联作用。因此，NF-κB在炎性反应和免疫反应中起着非常重要的调控作用[19]，而大多数癌症的发生、发展往往与NF-κB介导的炎性反应通路有着密不可分的联系[20]。此外，NF-κB信号转导通路与细胞凋亡也密切相关[21]。NF-κB被活化后通过对凋亡基因的调控，进而调控下游蛋白表达来参与细胞的凋亡过程，最终导致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase-3）的活化，Caspase-3的激活是细胞凋亡过程的最后关键步骤。以往研究发现，TLR4信号通路对多发性骨髓的增殖和凋亡起重要作用[22-33]。本研究结果表明，TLR4信号通路被抑制后，多发性骨髓瘤细胞的增殖抑制率、凋亡率均增高，且随TAK-242浓度的升高，细胞增殖抑制率、凋亡率亦随之增高，说明TAK-242可抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡。

综上所述，To l l样受体4特异性抑制剂TAK-242可抑制人多发性骨髓瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡，其机制可能为抑制TLR4/Myd88/NF-κB信号通路，提示阻断TLR4可能是治疗多发性骨髓瘤的潜在。方法，未来需在动物实验中进一步实验去验证TAK-242对人多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡的影响。