NRP-1单克隆抗体对乳腺癌裸鼠移植瘤生长的影响

马超，王卫星，苏新辉，陈国强，苏福

0 引言

乳腺癌被列为全球第二大最常见的癌症，是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一[1]。全世界每年约新增150万乳腺癌患者，同时有50余万女性死于该病[2]。目前，乳腺癌的治疗提倡手术、放化疗、内分泌及分子靶向治疗相结合的综合治疗措施，治疗水平较以往有了很大的提高，但是整体临床疗效仍不能让人满意，特别是晚期乳腺癌疗效依然较差。治疗失败的原因主要有原发肿瘤转移、治疗后复发和耐药，其中较早发生血行转移是主要因素[3]。因此，探寻治疗乳腺癌的新靶点，提高其疗效是仍然是亟待解决的临床难题。

Soker等发现神经纤毛蛋白-1（neuropilin-1,NRP-1）与血管生成存在关系，是血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的新型受体，在血管内皮细胞增殖和迁徙过程中有促进作用[4]。近来也有大量研究表明，NRP-1在血管生成方面起着重要作用，可能为抗血管生成治疗提供潜在的靶点。NRP-1在乳腺癌中高表达，而且可作为乳腺癌的独立预后因素[5]。已有研究通过沉默或过表达NRP-1观察乳腺癌细胞在细胞增殖、侵袭、转移和凋亡等生物学行为方面的变化，但是关于NRP-1单克隆抗体（NRP-1 monoclonal antibody, NRP-1 MAb）治疗乳腺癌裸鼠移植瘤的研究国内外尚未见报道。

本研究将从细胞水平检测NRP-1 MAb是否能有效识别乳腺癌MCF7细胞上的NRP-1蛋白，并从动物水平观察NRP-1 MAb对乳腺癌MCF7细胞移植瘤生长的影响，从分子水平检测肿瘤组织中VEGF、NRP-1的表达情况，分析潜在机制，从而为NRP-1单克隆抗体靶向药物的研究提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、材料

RPMI1640培养基、胎牛血清为GIBCO公司产品（美国），Hoechst染色试剂盒为上海碧云天生物技术有限公司产品（中国），羊抗鼠IgG-TRITC罗丹明（Tetramethylrhodamine, TRITC）荧光标记二抗为Sigma公司产品（美国），VEGF抗体为Abcam公司产品（美国），蛋白Marker/预染蛋白Marker、PVDF膜为Fermentas公司产品（美国），增强化学发光（Enhanced chemiluminescence,ECL）试剂盒为鹭隆公司产品（中国）。NPR-1单克隆抗体为厦门大学抗癌研究中心颜江华教授课题组馈赠[6]。

1.2 实验动物、细胞株

6~8周龄SPF级雌性BALB/C裸鼠，由厦门大学动物实验动物中心提供。乳腺癌MCF7细胞，为本实验室保存的细胞株。

1.3 细胞培养

乳腺癌MCF7细胞常规培养（在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养），每2~3 d传代，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.4 抗体特异性的鉴定

为了鉴定抗体的特异性，实验设有空白对照组（Blank control, BC），阴性对照组（Negative control, NC）。收集各组细胞，提取总蛋白，进行蛋白免疫印记（Western blot）检测。即经SDSPAGE电泳后将蛋白转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭膜后加入稀释的NRP-1 MAb（1:1 000），4℃反应过夜后取出用膜洗涤液（TBST）洗涤3次，加入HRP酶标二抗（1:8 000）室温反应1 h，洗涤5次，加入化学发光液反应，在凝胶成像仪成像。

将MCF7接种于盖玻片贴壁生长，当细胞长至80%左右，用4℃预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次；加入Hoechst 染色试剂盒的固定液0.5 ml，4℃固定30 min；弃掉固定液，PBS洗3遍，3 min每次。甩干，加入1:200稀释的NRP-1抗体，37℃孵育1 h，弃掉一抗溶液，PBS洗3遍，3 min每次；在细胞片上加1:50稀释的羊抗鼠IgG-TRITC荧光标记二抗，37℃避光孵育1 h，弃掉荧光二抗，PBS洗3遍，3 min每次；加入0.5 ml Hoechst染色液，于摇床上晃动，室温染色5 min，弃掉染色液，用PBS洗涤3遍。甩干，滴1滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的玻片，尽量避免气泡；共聚焦扫描显微镜下观察，其中Hoechst激发波长在350 nm左右，发射波长在460 nm左右；而TRITC最大吸引光波长为550 nm，最大发射光波长为620 nm。

1.5 裸鼠移植瘤模型的建立

取对数生长期的乳腺癌MCF7细胞，0.25%胰酶消化后加入含血清培养基中和胰酶，吹打成单细胞悬液。用PBS离心洗涤3次，弃上清液，细胞沉淀用PBS制成1×107个/毫升单细胞悬液，以每只0.2 ml注入裸鼠右前腋下。接种后隔天观察1次小鼠，记录皮下接种点的成瘤情况。当皮下成瘤并生长至约800 mm3时开始传代，剥离瘤块剪切成均匀的小块（2 mm×2 mm×2 mm），移植到30~35只裸鼠右前腋部皮下。

1.6 分组及用药

当小鼠移植瘤瘤体长至约100 mm3将荷瘤裸鼠按随机数字表法分为4组，每组6只。对照组（PBS组）腹部皮下注射PBS，0.2 ml，2次/周；NRP-1 MAb低剂量组腹部皮下注射NRP-1 MAb，1 mg/kg，2次/周；NRP-1 MAb 中剂量组腹部皮下注射NRP-1 MAb，5 mg/kg，2次/周；NRP-1 MAb高剂量组腹部皮下注射NRP-1 MAb，10 mg/kg，2次/周。以上各组均于瘤组织移植接种后第3天开始给药，共给药7次。

1.7 肿瘤重量、体积测量及抑瘤率

模型分组给药后，每天观察裸鼠的一般情况并记录：精神状态、食欲、体重等。隔5天测一次肿瘤长径（a）、短径（b）和小鼠体重。于治疗后第33天脱颈处死，剥离完整肿瘤，称重，投入液氮中保存、备用。用Steel公式计算肿瘤体积（V）。V = a×b2/2。抑瘤率（Tumor Growth Inhibition, TGI）（%）= （Cx-Tx）/Cx×100%（Cx为给药结束后PBS组测量的平均肿瘤体积，Tx为给药结束后各治疗组测量的平均肿瘤体积）。根据测量数据绘制治疗后肿瘤质量的变化，以及实验进程中小鼠体重变化等图表。

1.8 Western blot检测相关蛋白的表达

肿瘤组织研磨破碎，加蛋白裂解液，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。将等量蛋白样品点于SDS-聚丙烯酰胺凝胶小孔进行电泳。电泳后进行转膜，将转好的PVDF膜用TBST洗涤后、浸没于封闭液封闭，然后根据预染Marker所指示大小，将内参条带（GAPDH）和目的条带（VEGF、NRP-1）剪开，分别加入对应的一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入相应的二抗孵育30 min，洗涤数次，滴加ECL显影剂，通过设备曝光显影观察蛋白条带。

1.9 统计学方法

使用SPSS19.0统计分析软件对原始数据进行统计分析，最终结果数据用样本均数t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NRP-1单克隆抗体的特异性

Western blot。方法检测抗体特异性结果显示NRP-1 MAb能够与线性NRP-1蛋白结合，无明显杂带，见图1A。说明抗体特异性良好，且能应用于后续实验，即采用Western blot。方法检测肿瘤细胞PD-L1蛋白的表达量。

NRP-1 MAb孵育的乳腺癌细胞MCF7后经免疫荧光染色，使用荧光共聚焦显微镜观察结果。当使用550 nm做激发光，检测TRITC的荧光时，对照组的细胞检测不到红色荧光，而经NRP-1 MAb（标记有TRITC荧光）处理的细胞可以看到清晰的红色荧光；当使用350 nm做激发光，检测Hoechst的荧光时，可见细胞核带有蓝色荧光，且未对细胞核的形态造成损伤；将2个图像融合，融合图像显示未加抗体的细胞膜未出现红色荧光，而加入NRP-1 MAb的有红色荧光，且主要呈现在细胞膜上，见图1B。结果表明，NRP-1 MAb能够有效识别乳腺癌细胞MCF7上天然的NRP-1蛋白，且主要定位在细胞膜上。

2.2 各组裸鼠体重及肿瘤体积、重量的变化

实验进程中，各组荷瘤小鼠生长状况良好，饮食规律，排泄无异常，无意外伤害及死亡，成瘤率100%。肿瘤体积从给药后第3天开始测量，根据各个时间点的测量结果绘制肿瘤生长曲线。数据显示从第13天开始实验组的肿瘤体积明显要小于对照组（P=0.00018），不同NRP-1 MAb剂量给药组的抑瘤率随着给药剂量的增加而增高。NRP-1 MAb低剂量组（1 mg/kg）抑瘤率为47.01%，NRP-1 MAb中剂量组（5 mg/kg）抑瘤率为65.70%，NRP-1 MAb高剂量组（10 mg/kg）抑瘤率为69.19%，见图2。肿瘤的生长依赖于新生血管提供养分，而NRP-1在肿瘤血管生成中充当重要角色。NRP-1 MAb理论上可通过阻断NRP-1与其受体结合，抑制肿瘤血管生成，进而影响肿瘤的增长速度。实验结果显示与该推断一致。给药治疗33天后，剥离肿瘤组织称重，实验组的肿瘤明显小于对照组（高中低组相应的P值为：0.029、0.025、0.016），见图3。随着荷瘤小鼠给药进程，小鼠体重增长差异不大，无体重骤减现象，见图4。说明NRP-1 MAb用药对荷瘤小鼠毒副作用小。

图1 Western blot法(A)和共聚焦免疫荧光法(B)分析NRP-1 MAb的特异性Figure1 Specificity of NRP-1 MAb in MCF7 cells analyzed by Western blot(A) and Confocal immunof l uorescent analysis(B)

图2 治疗后各组裸鼠肿瘤的生长曲线(A)及大小(B)Figure2 Growth curves(A) and size(B) of tumors in nude mice after treatment

图3 治疗后各组裸鼠瘤体平均瘤重Figure3 Mean weight of tumors in nude mice after treatment

2.3 肿瘤组织中VEGF和NRP-1蛋白的表达

Western blot法分析各组中NRP-1和VEGF的表达。以GAPDH为内参蛋白进行调平，结果显示对照组肿瘤组织中NRP-1和VEGF均有表达，不同剂量用药组NRP-1和VEGF的表达则呈现递减趋势，见图5。

3 讨论

图4 治疗后各组裸鼠体重变化情况Figure4 Change of body weight of nude mice after treatment

图5 Western blot检测各组肿瘤组织中NRP-1和VEGF的表达Figure5 Expression of VEGF and NRP-1 in tumors of each group detected by Western blot

我国乳腺癌的发病率逐年上升，且具有年轻化的趋势。近年来，NRP-1如何参与肿瘤的发生发展过程已成为研究热点。在乳腺癌的研究中显示，恶性、癌前病变的乳腺样本中肿瘤脉管系统和肿瘤细胞表达有NRP-1蛋白，显示NRP-1可能和乳腺癌生长和进展有关[7]。

NRP-1作为VEGFR-2的共受体可增强VEGF165与VEGFR-2的结合，增加VEGFR2的蛋白磷酸化程度，负责诱导内皮细胞趋化作用，促进肿瘤血管生成[8]。而且，NRP-1还能够以不依赖VEGF的方式，通过与酪氨酸激酶ABL1形成复合物，重塑肌动蛋白，诱导血管新生[9]。Bachelder等[10]发现恶性乳腺癌细胞中激活VEGF诱导的PI3K信号转导通路的作用是非常重要的。在NRP-1阳性、VEGFR2阴性的乳腺癌细胞株中，VEGF165通过激活PI3k激酶通路阻止凋亡，并与NRP-1的水平和细胞生存直接相关[11]。另外，在介导乳腺癌迁移和转移中NRP-1也起了重要作用。这些研究共同提示了抗NRP-1可能为靶向治疗乳腺癌提供新的途径。

传统化疗药物旨在短时间内最大程度杀伤肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡，但较长的化疗间歇使得受损的肿瘤血管系统得以重建，不能带来持久疗效，且不良反应大，常伴有肿瘤耐药。靶向治疗作为据手术、放疗、化疗三大传统治疗手段之外的一种全新的治疗。方法，特异性强、不良反应小，能够改善化疗药的弊端。以NRP-1为靶点的分子靶向治疗研究，在结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等瘤种的体内外实验中体现出较好的抗肿瘤疗效[12]。

本研究在细胞水平上，通过Western blot和共聚焦免疫荧光法检测NRP-1 MAb的特异性，结果显示其可有效结合乳腺癌细胞MCF7上的NRP-1蛋白。NRP-1在肿瘤生长、发展中参与血管新生、肿瘤细胞侵袭等过程，本研究在动物水平上，探讨了NRP-1 MAb以不同剂量治疗乳腺癌细胞裸鼠移植瘤，不同NRP-1 MAb剂量给药组的抑瘤率随着给药剂量的增加而增高。为了进一步阐释疗效的潜在机制，本研究在分子水平上，初步检测了肿瘤组织中的VEGF和NRP-1的表达情况，结果显示高剂量用药后肿瘤组织中VEGF和NRP-1表达量下调，证实NRP-1 MAb可通过下调VEGF和NRP-1表达，而抑制肿瘤的增长。但是荷瘤小鼠肿瘤生长抑制实验结果显示，中、高浓度抗体的抑瘤作用却没有低浓度显著，提示肿瘤发生发展是个综合复杂的过程，涉及多物质多通路的参与，NRP-1 MAb抑制肿瘤生长不是唯一途径，只是机体中的一种途径，后续研究可以考虑联合用药来提高抗体在实际应用中的有效性。综上，NRP-1 MAb可能通过结合NRP-1蛋白而下调VEGF和NRP-1的表达，从而减少肿瘤组织中血管的生成，发挥一定的抑制肿瘤增长的作用。