闽西宁化2 个铁皮石斛品系离体培养条件的优化

潘 红，张 静，赖呈纯，黄贤贵，王 琦，高慧颖，

赖钟雄1*

（1.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州350002；2.福建省农业科学院农业工程技术研究所，福建福州350003）

铁皮石斛（Dendrobium candidumWall.ex Lindl.）属于兰科石斛属多年生草本附生植物，是我国传统名贵中药材，富含生物碱、多糖、类黄酮等活性物质[1]。铁皮石斛生长缓慢、自身繁殖能力低，但市场需求大，价格高。野生铁皮石斛因被过度采挖，环境破坏，已濒临灭绝[2]。目前，铁皮石斛是国家重点保护药用植物、中国珍稀濒危二级保护植物，已被列入中国植物保护红皮书[3]。铁皮石斛的自然分布区域非常广，生长环境差异较大，由此出现明显的种类变异，不同产地铁皮石斛茎表面的紫色斑点分布情况不同，有些紫色斑点少，密度较小，颜色浅，即称“青杆铁皮”；而有些产区的铁皮石斛茎紫色斑点较多，密度大，颜色呈紫红色，即称“红杆铁皮”[4]。红杆铁皮石斛的药用价值高于青杆铁皮石斛[5]，更受到消费者的青睐。不同品种的植物生长状态存在差异性，目前关于二者在组织培养过程中表现出的具体差异报道较少。该试验通过8 种培养基对闽西宁化2 个铁皮石斛品系的离体培养条件进行优化，以期筛选出适合2 个品系铁皮石斛丛生芽增殖、根系生长等的培养基，并比较二者之间的离体培养下的生长差异，从而为闽西宁化红杆铁皮石斛和青杆铁皮石斛的工厂化生产及次生代谢产物的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

闽西宁化红杆与青杆2 个铁皮石斛品系来源于福建省清流县邱元农业发展有限公司兰花资源圃，由福建省农业科学院农业工程技术研究所食品资源研究室通过茎段直接诱导不定芽获得的试管苗。

1.2 方法

1.2.1 离体培养优化培养基配方。根据前期试验的结果，设计了8 组培养基对2 个铁皮石斛品系丛生芽增殖进行优化，培养基配方如下：

T1：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L；T2：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L；T3：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+Amp（氨苄青霉素）1 mg/L；T4：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+Amp 1 mg/L；T5：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+土豆泥200 g/L；T6：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+土豆泥200 g/L；T7：MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+香蕉泥200 g/L；T8：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+香蕉泥200 g/L。

含有Amp 的培养基，在培养基灭菌后冷却至40℃左右添加，摇匀分装。香蕉泥用新鲜果实打浆而成，土豆泥用新鲜块茎去皮打浆而成。所有培养基均添加蔗糖30 g/L，琼脂6 g/L，pH 5.8。于高压灭菌锅中121℃、0.11MPa 下高温灭菌20 min。

1.2.2 接种与培养。切取生长状态一致且带1 个腋芽的去叶茎段，横放接种到丛生芽增殖培养基上，每瓶接种3 个茎段，接种5 瓶，重复3 次。培养条件为温度（25±1）℃，光照强度4 000～5 000 lx，光照时间12 h/d。培养至60 d 统计红杆和青杆铁皮石斛丛生芽的株高、芽数和增殖系数，观察生长状况。

增殖系数=增殖所得丛生芽的总芽数/接种的总茎段数

1.2.3 生根壮苗培养。选择生长健壮的试管苗，切取具有4～5 片真叶、3 cm 左右高度的芽苗接种于生根培养基1/2MS+NAA 0.2 mg/L+香蕉泥100 g/L+1 g活性炭+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L，pH 5.8。每瓶接种5个芽苗，接种5 瓶，重复3 次。培养条件同上，培养至60 d，统计1 级根数量、2 级根数量、根系长度、丛生芽数量。对比2 个品种之间生根壮苗的差异。

1.2.4 炼苗移栽。生根壮苗培养试管苗生长至60 d时，进行炼苗移栽。

1.2.5 数据处理。运用Excel 2010 进行数据处理和图表绘制，利用DPS 进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对红杆铁皮石斛生长的影响

2.1.1 生长状态。不同处理的培养基对红杆铁皮石斛丛生芽生长状态具有较大的影响。从形态上观察，T1 培养基丛生芽茎段相比于T2 培养基较为粗壮，叶片大而浓绿（图1A 和图1B）。添加Amp 增殖的丛生芽，短缩细弱，丛生芽诱导不整齐一致，有的茎段只长几个较大丛生芽，有的则紧缩成团（图1C 和图1D）。T5、T6 和T7、T8 培养基则中部分茎段黄化死亡，内生菌大量出现。在培养过程中，T5、T6 培养基内生菌增殖最为明显，其次是T7、T8 培养基。T5、T6培养基中的红杆铁皮石斛叶片变短并出现明显红色（图1E 和图1F），T8 也出现叶片短小叶色变红的现象（图1H）。

2.1.2 丛生芽增殖。红杆铁皮石斛在不同培养基中丛生芽增殖系数见图2。只添加KT 和6-BA 的培养基T1 与T2 之间具有极显著性差异，6-BA 有利于丛生芽的增殖。添加Amp 后，T1 培养基的增殖能力极显著提高，此时T3 与T4 培养基之间对丛生芽增殖影响差异不大，T4 的增殖系数达到11.72，为所有优化培养基中增殖系数最高。T5、T6 和T7、T8 培养基的丛生芽增殖系数极显著下降，之间增殖系数不存在差异性，其中T8 培养基增殖系数低至1.35。

图1 红杆铁皮石斛在不同培养基上的生长情况

图2 不同培养基对红杆铁皮石斛丛生芽增殖系数的影响

2.1.3 丛生芽株高。结合图2、图3 可以看出，丛生芽增殖与株高成反比。增殖系数越大，株高值越小。添加KT 的培养基和添加6-BA 的培养基在株高上具有差异性。T1 与T2 培养基之间株高具有极显著性差异，KT 有促进红杆铁皮石斛伸长生长的作用。对比几个添加KT 的处理，以含有KT 为基础的培养基上添加Amp、土豆泥、香蕉泥并不能使红杆铁皮石斛株高更高。T8 培养基含有6-BA，其诱导的丛生芽株高与T7 对比，存在显著性差异，香蕉泥的添加，增殖系数少，植株营养竞争小，都可能促进T8 培养基中红杆铁皮石斛伸长生长。

图3 不同培养基对红杆铁皮石斛丛生芽株高的影响

2.2 不同培养基对青杆铁皮石斛生长的影响

2.2.1 生长状态。不同培养基诱导的青杆铁皮石斛丛生芽生长状态存在较大差异，从形态上看，添加KT 的培养基，除T5 外，T1、T3、T7 培养基都能促使青杆铁皮石斛伸长生长，叶色浓绿，根系生长较多（图4M、4I、4K 和图4O）。添加6-BA 的培养基，除T6外，T2、T4、T8 培养基都能促使青杆铁皮石斛茎段短缩，萌发较多的丛生芽，根系较少。添加土豆泥的T5、T6 培养基会使内生菌大量生长，青杆铁皮石斛几乎不增殖。香蕉泥的使用，青杆铁皮石斛部分茎段死亡，丛生芽诱导少，植株叶片易变红，但根系生长却最为粗壮，根系上的白色绒毛多（图4O 和图4P）。

图4 青杆铁皮石斛在不同培养基上的生长情况

2.2.2 丛生芽增殖。从图5 中的增殖系数中可看出，T1 与T2 培养基之间存在极显著性差异，6-BA 对青杆铁皮石斛丛生芽分化具有促进作用。T4 培养基最有利于丛生芽增殖，增殖系数达到32.56，与其他处理组之间存在极显著性差异。T3 培养与未添加Amp的T1 处理相比，出现了抑制，抑制结果为极显著性差异。与红杆铁皮石斛一样，T5、T6 培养基和T7、T8培养基对丛生芽的增殖具有极显著的抑制作用，T5培养基增殖系数最低为0.26。

2.2.3 株高。结合图5、图6 可看出，青杆铁皮石斛丛生芽增殖系数与株高成反比。增殖系数越大，株高值越小。从数据上可以看出，KT 有促进植株增高的作用。其中添加香蕉泥的T7 培养基对青杆铁皮石斛的株高产生了极显著的促进作用，平均株高达到2.92 cm。T8 培养基含有6-BA，其株高与只添加KT 的T1 培养基无差异，香蕉泥能够促进青杆铁皮石斛的生长。

2.3 2 个品系铁皮石斛生根壮苗的差异

结合丛生芽增殖的结果，接种的单株来源于T1培养基生长较高且健壮的茎段，设计了添加香蕉泥的生根培养基用于2 种铁皮石斛的生根壮苗培养。从表1 可以看出，红杆与青杆铁皮石斛2 个品系间，1 级根系数存在显著性差异，红杆铁皮石斛生根能力略强于青杆铁皮石斛；2 级生根系数不存在差异；根系长度存在显著性差异，青杆铁皮石斛的平均根系长度较红杆铁皮石斛长；平均分蘖数存在显著性差异，红杆铁皮石斛分蘖能力较青杆铁皮石斛弱。从图7 可看出，2 个品种之间生长状态差异不明显，均根系发达健壮，叶色浓绿，茎段较粗，生长旺盛。

2.4 炼苗移栽

图7 2 个品系铁皮石斛生根壮苗

表1 2 个品系铁皮石斛生根差异性

将在生根壮苗培养基中培养60 d 的铁皮石斛出瓶苗移至常温下闭盖炼苗3 d，再进行松盖炼苗3 d。轻取试管苗，在清水中轻柔洗净根部培养基。阴干后种植于松树皮基质中。定植后浇水，遮阴，每天早晚喷水，保持空气湿度在80%左右。2 周后可见茎尖伸长，移栽成活率可在80%以上。

3 结论与讨论

（1）综合试验数据，能够分析出2 个品系铁皮石斛丛生芽生长情况的差异性。青杆铁皮石斛和红杆铁皮石斛在8 种优化培养基所表现出的丛生芽增殖趋势大致相似。6-BA 的添加对红杆铁皮石斛、青杆铁皮石斛的丛生芽增殖都有着极显著的促进作用。KT 对丛生芽增殖诱导效果没有6-BA 强，但红杆铁皮石斛、青杆铁皮石斛植株都表现出生长健壮、叶色浓绿等优势。在纯添加激素的培养中，红杆铁皮石斛丛生芽的增殖能力小于青杆铁皮石斛，青杆铁皮石斛在T1 培养基中增殖系数是红杆铁皮石斛的2.11倍，青杆铁皮石斛在T2 培养基中的增殖系数是红杆铁皮石斛的1.89 倍。2 个品种共同表现出丛生芽增殖系数越高，相对应的株高越矮的趋势。红杆铁皮石斛、青杆铁皮石斛在T1 培养基、T2 培养基中的株高无明显差异。

（2）植物生长调节剂在铁皮石斛组织培养中起到关键作用，红杆铁皮石斛在T2 培养基中丛生芽增殖系数是T1 培养基的1.68 倍。青杆铁皮石斛在T2培养基中丛生芽增殖系数是T1 培养基的1.50 倍。6-BA 是最有利于丛生芽增殖的细胞分裂素，这与李玉萍等[6]、邓成华等[7]、琚淑明等[8]报道相一致。促进伸长生长最佳细胞分裂素是KT，T1 培养基中生长的红杆铁皮石斛株高是T2 培养基的1.81 倍。T1 培养基培养的青杆铁皮石斛株高是T2 培养基的1.50 倍。综合试验结果认为，诱导红杆铁皮石斛和青杆铁皮石斛丛生芽增殖的最佳培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，丛生芽增殖多，且较为一致。壮苗最佳培养基为MS+ KT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，植株茎段较粗，叶色浓绿，生长较快。在无内生菌的情况下，可添加香蕉泥。

（3）植物内生菌在一定阶段或全阶段生存于植物体内，与植物形成一种互利共生的关系，铁皮石斛为兰科植物，内生菌是普遍存在的，内生菌在其生长过程中发挥了重要作用[9-11]。试验材料所用的铁皮石斛内生菌为细菌，存在于接种前期，植株生长起来后，逐渐消失，后期肉眼观察不到。Amp 是常见的抗生素，对抑制细菌的生长具有一定作用[12]，Amp 的添加抑制了铁皮石斛内生菌的生长，红杆铁皮石斛在添加Amp 的培养基中表现出促进，T4 则极显著的促进青杆铁皮石斛丛生芽增殖，而生长在T3 培养基中出现了抑制，抑制原因尚不明确。土豆泥的添加使培养基中氮源、碳源含量增加，给内生菌营造了良好的生长条件，内生菌与植株间的平衡被打破，红杆铁皮石斛、青杆铁皮石斛茎段易死亡，丛生芽难以诱导。也有报道称土豆泥能够促进植株株高生长，但不利于分蘖[13]，这在红杆铁皮石斛中表现明显。香蕉泥也会使内生菌增加，但增加量没有土豆泥培养基多。香蕉泥有助于铁皮石斛株高的生长以及根系的形成。蒋林等[14]、罗焕明等[15]都在研究添加物对铁皮石斛组织培养的影响中发现，香蕉有利于生根。土豆泥和香蕉泥中的青杆铁皮石斛、红杆铁皮石斛出现红色叶片，可能是内生菌含量的增多，对植株产生胁迫作用，花青素含量增加。

（4）红杆铁皮石斛与青杆铁皮石斛在生长上具有一定差异性。在组织培养的过程中，二者的表皮颜色并未出现明显的区别。红杆铁皮石斛丛生芽增殖能力弱于青杆铁皮石斛；株高上二者无较大差异，青杆铁皮石斛的增殖能力又高于红杆铁皮石斛，推测红杆铁皮石斛在伸长生长上也略慢于青杆铁皮石斛。在生根壮苗上，红杆铁皮石斛的根系长度和分蘖数都低于青杆铁皮石斛，1 级根系数高于青杆铁皮石斛。红杆铁皮石斛较青杆铁皮石斛生物含量高，更具有药用价值[5，16]。红杆铁皮石斛丛生芽增殖能力弱，伸长生长较慢都有利于有效物质的积累。