环境污染物引起的内质网应激诱导神经系统损伤

2019-05-05

福建质量管理 2019年8期

(西北矿冶研究院甘肃白银 730900)

一、前言

近几十年来，随着世界经济的一体化发展，工业化规模也日趋庞大，大量人工合成的化学品释放入环境。化学污染物通过饮用水、食物、土壤和大气等环境介质与包括人类在内的环境生物体系全方位地接触，成为本世纪初急需治理的“第三代污染”，其对生态环境和人类健康与生存可能带来的潜在危害及其防治，成为新世纪的重大研究课题。经过大量研究发现，内质网应激在各种原因导致的机体损伤，如肝损伤，神经损伤中，占有十分重要的作用，其机制也得到越来越多的关注。

二、三氯乙烯简介及研究进展

三氯乙烯(Trichloroethylene,PCE)是一种常见的重要的工业有机溶剂，为无色液体，有类似氯仿的嗅味，分子量131.4，沸点86.7℃，易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，不溶于水，具有较强的脱脂作用，可用做金属脱脂剂、萃取剂、干洗剂、溶剂等，广泛应用于五金、电子、玩具、印刷等行业。在工业生产和使用过程中三氯乙烯可以通过呼吸道、消化道和皮肤吸收，由于作业人员通常是手工作业，致使皮肤直接接触吸收在三氯乙烯的致病中具有非常重要的意义。

三、污染物对生物的影响

污染物通过多种途径进入生物机体后，一部分经代谢排出体外，而有些污染物或污染物的代谢产物会对生物产生毒性作用。已有研究表明，污染物对生物机体的影响首先作用于生物大分子，在不同水平(器官、细胞、分子等)上引发各种各样的毒性效应。随着对毒物危害机体的本质逐步深入研究，目前有关化学物质的毒作用机制主要包括：自由基与氧化损伤，外源性化合物共价结合，细胞钙稳态紊乱等。

四、氧化损伤在神经毒性中的作用

自由基氧化损伤是多种神经功能紊乱以及脑功能紊乱的病理学原因之一，同时也和神经细胞凋亡、炎症反应的发生密切相关。在正常情况下，体内氧自由基的产生和清除是平衡的。当自由基的产生过多或体内抗氧化系统出现故障，体内氧自由基代谢就会出现失衡，自由基蓄积过多攻击机体，即为氧化应激。

氧化应激不但可以直接损伤细胞，导致细胞坏死，它还可以通过介导线粒体途径、DNA修复酶及转录因子等间接导致细胞凋亡。

五、紫甘薯花青素简介及研究进展

紫甘薯花青素(Purple Sweet Potato Color,PSPC)是紫色甘薯(Ipomoea.Batatas Lam.)中提取的黄酮类化合物，其具有抗氧化和消除自由基、降低血清和肝脏中脂肪含量、抗突变、抗肿瘤、防止人体内过氧化、提高视力等作用，红色至紫红色的粉状物、糊状物或液体，易溶于水、乙醇和丙酮等，不溶于石油醚等有机溶剂。因其吡喃环上有酚羟基以及四价氧原子，所以其同时具有酸和碱的性质，对酸碱十分敏感，其色调和稳定性易受PH值影响。己有实验证明PSPC具有抗衰老，抗辐射损伤，抗肿瘤等多种生物活性。本实验依据PSPC降低炎症的作用来研究PSPC对PCE诱导的内质网应激引起的神经系统损伤是否具有保护作用，具有一定的医学和社会意义。

六、材料与方法

(一)实验动物分组及处理

8周龄雄性C57 BL/6J小鼠40只，体重为22.43±3.23g，动物购自北京华阜康生物科技股份有限公司。实验开始前，动物被饲养在室温为23 1℃，湿度是60%房间里。小鼠被随机分为4组每组10只，12小时有光/12小时黑暗(光照8：30-20：30)，小鼠可以自由饮水和进食。在小鼠适应实验室条件后，随机分为四组的小鼠收到不同的食物和饮水，分别为：(1)对照组；(2)PCE组；(3)PCE+PSPC组；(4)PSPC组。分别灌喂2000mg/kg/d的PCE，PCE+PSPC，PSPC，连续处理三周。进行行为学实验。所有的实验动物的管理和处理按照中国实验动物管理的法规执行。

(二)药品与仪器

三氯乙烯(PCE)、紫甘薯花青素(PSPC)

LEICA CM1900恒冷切片机

LEICA SP5双光子激光共聚焦

Biofuge primoR高速冷冻离心机(Heraeus)

高速冷冻离心机(德国Eppendorf生产，型号为5810R)

ABI 2400 PCR仪

Bio-Rad凝胶成像分析仪

DYY-10型ECP300三恒电泳仪(北京市六一仪器厂)

DYCZP 40B型电泳槽(北京市六一仪器厂)

WD一9412A型恒温循环器(北京市六一仪器厂)

WD-9405型水平摇床(北京市六一仪器厂沃德生物医学仪器分厂)

MP200A电子天平

电动匀浆器(联邦德国Braun厂产品，型号为Potter-Elvehjem Tissue Grinders-1020259)

(三)组织样品处理

最后一次灌喂PCE 24小时后，将小鼠用乙醚深度麻醉，处死，迅速取出脑组织，放于1/10(w/v)PBS(含蛋白酶抑制剂)中放于冰上匀浆后，5000×g，4℃，离心15min。收集上清液，放于-70℃储藏，用于生化指标的测定。

七、ROS的测定

(一)测定方法及原理

我们采用DCF二氯荧光法对小鼠大脑细胞内产生的ROS进行监测，通过分析氯甲基二氢荧光素乙酯(CM-H2DCFDA)荧光探针最后产生的荧光密度而得出最终数值。CM-H2DCFDA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成H2DCF，而H2DCF不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的H2DCF生成强荧光的二氯荧光素DCF。通过检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

(二)操作方法

分离后的脑细胞组织液加入10μM二氯荧光乙酰乙酸盐H2DCFDA于37℃孵育30min，用KHB缓冲液冲洗细胞三次洗掉多余染料后，用酶标仪在激发波长480nm，发射波长530nm条件下测定荧光密度值。没有用染料处理的细胞用来检测背景荧光值以去除本底干扰，最终荧光密度通过Bradford法对蛋白质浓度的测定来进行标准化。

八、药物对机体内ROS的影响

CTLPCEPCE+PSPCPSPCROS(pmolDCF formed/min/mg protein)2.57.63.12.4SD0.140.920.220.18

图1药物对ROS的影响

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是外源性氧化剂或细胞内有氧代谢过程中产生的具有很高生物活性的氧分子，如O2-，·OH和脂质过氧化物等。在特定条件下，低水平的氧自由基能诱导细胞凋亡，而活性氧被认为在细胞凋亡过程中广泛存在。

从图1可以看出，用PCE染毒时，与对照组所测得的值相比，导致小鼠体内ROS的含量迅速上升，且为最高，其值为7.6。用PCE和PSPC联合作用时，发现ROS的水平又有了大幅度的下降，下降至3.1，与对照组相比，还是要高于对照组。用PSPC染毒作用时，测得ROS值为2.4，与对照组相差无几，基本视为无变化。