桂枝茯苓胶囊对模型大鼠子宫肌瘤中孕激素受体及子宫平滑肌细胞的影响

范华农，龚义凤

作者单位：1浠水县中医院妇产科，湖北 黄冈 438200；2繁昌县中医院妇产科，安徽 芜湖 242400

子宫肌瘤又称子宫平滑肌瘤，由平滑肌及结缔组织组成，是女性生殖系统最常见的良性肿瘤，育龄期妇女平均发病率约为77%，发病率呈逐年上升的趋势［1-2］。其常引起月经过多、不孕、流产等疾病，也是女性子宫切除的常见原因，严重影响病人身心健康。据相关文献报道，雌、孕激素是子宫肌瘤形成发展的重要因素，且与雌、孕激素受体（ER、PR）有很重要的联系，还与子宫平滑肌细胞蛋白激酶C（PKC）关系密切。PKC是调节平滑肌细胞收缩、受体结合、细胞增殖分化的信号传递通道的重要物质，其降低有促进体外培养的子宫平滑肌瘤细胞生长抑制的作用，桂枝茯苓胶囊由桂枝、茯苓、牡丹皮等中药组成，具有活血化瘀，缓消癥块之效。临床应用于子宫肌瘤疗效显著［3］。笔者通过观察PR和PKC对造模大鼠子宫肌瘤的表达影响，进一步探析桂枝茯苓胶囊对子宫肌瘤的作用机制。

本研究起止时间为2016年1月至2017年1月。

1 材料与方法

1.1 实验药物及试剂桂枝茯苓流浸膏：桂枝茯苓胶囊（成分相同）（江苏康缘药业股份有限公司生产，浓度0.31 g/mL，批号20160507）用量按成人与大鼠等效用量换算而成。米非司酮片：每片25 mg（北京紫竹药业有限公司，批号43181709）配制成浓度为0.27 mg/mL的溶液备用（溶于丙二醇中）。黄体酮注射液：20 mg/mL（浙江仙琚药业，批号021603）。苯甲酸雌二醇注射液：2 mg/mL（天津金耀氨基酸药业，批号021865）。PR单克隆抗体（德国Biometro公司）。仪器：Leica荧光倒置显微镜（上海洛丰精密检测仪器有限公司）；Thermo-CO2培养箱（美国Thermo Forma公司）；SP试剂盒（美国Beckman Coulter公司）。

1.2 动物分组SPF级Wistar雌性大鼠体质量范围180～220 g，共81只，采用随机数字表法分为正常组14只，造模组67只。本研究符合一般实验动物伦理学原则。

1.3 造模方法正常组：14只，肌注0.9%生理盐水0.05 mL（3次/周）；造模组：67只，肌注苯甲酸雌二醇0.06 mL（含药量0.12 mg，3次/周），同时肌注黄体酮0.05 mL（含药量1 mg，1次/周）；共16周。造模过程中正常组1只丢失，造模组2只丢失及6只意外死亡，造模结束时正常组共13只，造模组共59只。

1.4 给药方法造模组59只模型大鼠分为三组：模型组17只，桂枝茯苓组21只，米非司酮组21只。每只模型组大鼠每天灌服0.9%生理盐水2 mL，其他两组每只大鼠每天分别灌服桂枝茯苓流浸膏或米非司酮溶液2 mL，共灌服12周（用量按成人与大鼠等效用量换算而成）。灌胃时间较长，结束时大鼠死亡11只，剩余正常组13只，模型组16只，桂枝茯苓组17只，米非司酮组15只。

1.5 观测指标大鼠在灌胃第12周时，取大鼠子宫组织放入甲醛溶液中固定，观察大鼠子宫各项指标并用SP法检测各组子宫平滑肌组织的PR，免疫组化法计算各组PKC的活性。

1.6 免疫组化方法（1）孕激素受体染色流程：标本切片脱蜡水化→甲醇处理切片→水洗、PBS洗→加血清孵→PR单抗放置过夜→PBS洗→加入SP复合物孵育→PBS洗→链霉卵白素孵→PBS洗→DAB-孵育→PBS洗，水洗→Harris苏木素复染→水洗→分化，蓝化，脱水封片。

（2）PKC提取：取大鼠子宫平滑肌细胞→缓冲液孵15 min→粉碎细胞→离心→上清液为细胞质PKC提取物→沉淀→离心→胞膜PKC提取物（上清液）。

1.7 结果判定（1）切片中不同高倍视野细胞计数共1 000个，得出阳性率，细胞核中棕黄色颗粒为孕激素受体阳性染色，其中无阳性细胞以（－）表示；阳性染色细胞＜25%（+）；25%＜阳性染色细胞＜50%（++），阳性染色细胞＞50%（+++）。

（2）将PKC加入到含有组蛋白、γ-32 P-ATP和磷脂酰丝胺酸的缓冲液中，温浴30 min，30℃，用γ-闪烁计数仪检测放射性，计算PKC的活性（PKC活性单位：fmol·mg-1min-1）。

1.8 统计学方法采用SPSS 22.0软件处理数据。计量数据用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析+HSD-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠质量、子宫质量及子宫系数差异比较本实验研究参照相关文献资料［3-4］改进后建立子宫肌瘤模型。监测模型大鼠质量、子宫质量、子宫系数（即子宫质量/大鼠质量），其结果均明显大于正常组大鼠（P＜0.05）；而用药组大鼠质量、子宫质量、子宫系数低于模型组（P＜0.05）；桂枝茯苓组大鼠质量、子宫质量、子宫系数与米非司酮组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠质量、子宫质量和子宫系数/±s

表1 各组大鼠质量、子宫质量和子宫系数/±s

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别正常组模型组桂枝茯苓组米非司酮组F值P值鼠数13 16 17 15鼠质量/g 185.2±19.8 348.3±50.3a 335.2±46.5ab 325.7±30.2ab 50.39 0.000子宫质量/mg 1.43±0.56 4.67±1.31a 3.55±0.73ab 3.50±0.82ab 30.74 0.000子宫系数/%0.77±0.12 1.34±0.11a 1.06±0.51b 1.07±0.48b 5.736 0.002

2.2 各组大鼠子宫平滑肌组织中PR阳性率及平滑肌细胞PKC的表达差异比较模型组大鼠子宫平滑肌组织细胞核中PR的阳性率、细胞膜PKC的活性均极显著高于正常组（P＜0.05），细胞质PKC的活性低于正常组（P＜0.05）。

用药后，PR阳性表达率，桂枝茯苓组与模型组比较下降极其显著（P＜0.05），米非司酮组与模型组比较下降显著（P＜0.05），桂枝茯苓组下降更明显接近正常组水平（P＞0.05）。

PKC细胞膜的活性表达，桂枝茯苓组与模型组比较下降极其显著（P＜0.05），米非司酮组细胞膜的活性下降不明显与模型组相比较多差异无统计学意义，桂枝茯苓组更接近正常组。

PKC细胞质的活性表达，桂枝茯苓组与模型组比较升高明显（P＜0.05），桂枝茯苓组PKC细胞质的活性升高多接近正常组表达；米非司酮组与模型组比较升高不明显。见表2。

表2 各组大鼠子宫平滑肌PR阳性率及平滑肌细胞PKC活性表达/± s

表2 各组大鼠子宫平滑肌PR阳性率及平滑肌细胞PKC活性表达/± s

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别正常组模型组桂枝茯苓组米非司酮组F值P值鼠数13 16 17 15细胞膜/fmol·mg-1·min-1 19.31±3.84 37.24±7.12a 21.62±5.23b 36.54±6.79a 37.27 0.000细胞质/fmol·mg-1·min-1 15.43±4.59 11.68±4.68a 16.50±2.80b 13.23±3.45b 4.90 0.004 PR阳性率（给药后第12周）/%28.34±2.4 75.25±4.1a 32.25±2.8b 40.22±3.5b 656.10 0.000

3 讨论

目前研究发现，子宫肌瘤是激素依赖性良性肿瘤，雌、孕激素在子宫肌瘤的生长中起协同作用，此外还与子宫平滑肌PKC活性密切相关［4-5］。相关研究表明［6-7］，子宫肌瘤内ER和PR的含量高于子宫正常肌组织，使用促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-α）治疗后的子宫肌瘤中ER和PR的表达均明显下降，说明肌瘤的生长与雌、孕激素受体有很重要联系。Kawaguchi等［8］发现雌、孕激素均导致细胞有丝分裂率增加，与单用雌激素或无激素培养基中培养细胞的相比，在雌、孕激素培养基中培养的细胞肌丝和致密体显著增多，增生最活跃。Matsuo等［9］发现凋亡抑制基因产物Bcl-2蛋白和增生抗原Ki-67在肌瘤组织中明显增多，表明孕激素是通过增强细胞内转录活化作用，实现提高有丝分裂率，达到抑制细胞凋亡的目的以促进肌瘤生长。本研究与相关文献报道研究结果一致，模型组子宫肌瘤平滑肌组织的细胞核中PR阳性表达率显著高于正常组。表明局部高PR浓度和高孕激素状态可能是子宫肌瘤发生发展的重要机制。桂枝茯苓组与模型组相比，局部PR阳性表达率明显下降，由于孕激素具有促进肌瘤生长并通过与PR结合发挥生物学效应来降低PR含量的作用，进一步证实了桂枝茯苓胶囊抗增生、抗肌瘤机制。

实体肿瘤微环境中缺氧是其基本特征之一，细胞在缺氧状态下诱导血管生成、缺氧代谢等密切相关的基因表达是为适应缺氧环境［10-12］，缺氧刺激子宫平滑肌细胞可以引起其细胞膜和细胞质PKC活性的明显改变。细胞质中的PKC活性下降，显示缺氧可激活细胞质中的PKC信号传导通路使细胞质中PKC活化。PKC是一种重要的信息传导蛋白，介导生物信号从细胞膜向细胞核的传递，构成细胞内重要的信号转导系统，对细胞分化、增殖和凋亡起重要调节作用［13-15］。本研究中细胞PKC是调节子宫平滑肌细胞收缩、受体结合、细胞增殖分化的信号传递通道的重要物质；主要以非活性形式存在于细胞质，当细胞质PKC激活时，会发生质膜转位［16］，桂枝茯苓胶囊与米非司酮组比较更能显著改善细胞PKC活性，促进平滑肌细胞PKC从病理性异常状态恢复到接近正常水平，而且改善了子宫平滑肌细胞的缺氧状态，切断子宫平滑肌细胞增殖分化信号传递通道，从而达到抑制肌瘤的目的。

本研究提示桂枝茯苓胶囊显著下调子宫肌瘤模型大鼠平滑肌细胞PR、PKC阳性表达，改善子宫平滑肌细胞的缺氧状态，抑制血管生成，切断子宫平滑肌细胞增殖分化信号传递通道，是桂枝茯苓胶囊缩瘤、消瘤临床疗效显著的作用机制之一。