老山芹全株及其不同部位酚类物质含量及抗氧化能力分析

王 炬，张秀玲*，高 宁，王韵仪

（东北农业大学食品学院， 黑龙江 哈尔滨 150030）

具有药用功效的植物一般含有多种化学物质，其中许多具有很强的抗氧化活性[1]。近年来研究表明，含有多酚化合物的植物表现出了很强的体外抗氧化能力[2]。多酚化合物是一类具有多羟基酚类化合物的总称，具有清除自由基、抗衰老、防辐射等抗氧化活性。植物中的多酚化合物可从全株植物中提取，也可从植物的叶、茎和根系中提取，且不同部位提取出的多酚化合物含量与组成均不相同，体现着不同的抗氧化活性[3-4]。

老山芹（Heraclenm dissectum）是伞形科多年生草本植物，多分布于黑龙江、吉林地区，是生活在东北林区的居民经常食用的一种山野菜，被认为是能够预防、治疗高血压、高血脂、糖尿病等疾病的一种野生植物。老山芹的季节性、地域性等生长特性限制了其行业发展，但随着国家对于林下资源的重视和育种、栽培业的高速发展，目前已解决了各项限制因素，并在黑龙江省大面积种植、推广老山芹，其资源十分丰富[5-7]。随着人们对于健康饮食、以食养生等生活方式的推崇，老山芹这种药食兼备的植物将会逐渐被人们重视。Gao Yang等[8]通过核磁共振技术在老山芹根部提取物中鉴定出了5 种常见的香豆素类化合物和芹菜素、山柰酚类物质，发现老山芹中的化学成分绝大部分为香豆素类化合物，芹菜素为黄酮类化合物的主要成分。Zhang Hailong等[9]在老山芹甲醇提取物中检测并鉴定出了茴芹香豆素、7-羟基香豆素等香豆素类化合物。Wang Hongzheng[10]、Sharififar[11]等发现芹菜素对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧阴离子自由基及羟自由基有较强的清除能力；Thuong[12]、Yu Jun[13]等发现香豆素类化合物对于DPPH自由基具有较强的清除能力，且抗氧化能力较强。目前国内外鲜有对于老山芹及其不同部位提取物体外抗氧化活性的相关研究。本研究通过测定、分析老山芹及其不同部位总多酚、总黄酮与5 种抗氧化活性指标，以期为老山芹功能性食品的开发与研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

老山芹全株植物及老山芹叶、茎均采自黑龙江省加格达奇农林科学院基地，全部原材料均在1 m的正方形标记区域中采摘，生长周期为7～10 d，2017年4月采收总长度为20 cm（根部距离叶片尖端）全株老山芹，并分离其叶、茎。

福林-酚试剂、没食子酸标准品（色谱纯）、芦丁标准品（色谱纯）、DPPH、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）二铵盐 美国Sigma公司；VC、水溶性VE（Trolox） 北京Solarbio公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；YP20002电子天平 上海越平科学仪器有限公司；LGJ-1A-50型真空冷冻干燥机 北京亚泰科隆仪器技术有限公司；5428型离心机 德国艾本德公司；G70D20CN1P-D2（S0）型微波炉 格兰仕微波生活电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备

全株老山芹及老山芹嫩叶、嫩茎均在同一地点、同一时间段内采摘，真空冷冻干燥，粉碎过60 目筛，密封低温保藏备用。多酚的提取方法在李晓英等[3]的基础上有所改进：精确称取1 g样品粉末于三角瓶中，加入100 mL经盐酸酸化后的体积分数70%甲醇溶液（甲醇与盐酸体积比100∶0.1），在功率为100 W的微波装置中浸提30 min，冷却至室温，过滤至棕色容量瓶中4 ℃冷藏备用。

1.3.2 总多酚含量的测定

总多酚含量的测定采用福林-酚法，结果以每克干样品中没食子酸质量表示。取样品提取液1 mL于带刻度试管中，定容至6 mL，加入1 mL福林-酚试剂，充分混匀后加入3 mL 75 g/L碳酸钠溶液，振荡摇匀，于75 ℃水浴避光反应30 min，在765 nm波长处测定吸光度。以没食子酸为标准品在相同条件下测定其吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程为y＝5.39x+0.021（R2＝0.999 1），其中y为吸光度，x为质量浓度/（mg/mL）。没食子酸在0.02～1.00 mg/mL范围内具有良好的线性相关性。按式（1）计算总多酚含量。

式中：ω为样品中总多酚含量/（mg/g）；ρ为由回归方程计算出的提取液总多酚质量浓度/（mg/mL）；V为提取液总体积/mL；N为稀释倍数；m为样品质量/g。

1.3.3 总黄酮含量的测定

采用硝酸铝显色法测定总黄酮含量，结果以每克干样品中芦丁质量表示。取样品提取液1 mL，加入5 mL蒸馏水、1 mL 50 g/L亚硝酸钠水溶液，振荡混匀，静置6 min后加入1 mL 100 g/L硝酸铝水溶液，振荡混匀，静置6 min，加入10 mL 100 g/L氢氧化钠水溶液，振荡混匀，充分反应15 min。在510 nm波长处测定其吸光度。以芦丁为标准品在相同条件下测定其吸光度，绘制标准曲线，得到线性回归方程为y＝0.787x+0.005（R2＝0.999 6），其中y为吸光度，x为质量浓度/（mg/mL）。芦丁在0.04～0.20 mg/mL范围内具有良好的线性相关性。按式（1）计算总黄酮含量（ω），其中ρ为由回归方程计算出的提取液总黄酮质量浓度/（mg/mL）。

1.3.4 铁还原能力的测定

参照阎林茂[14]、杨少辉[15]等的方法，分别吸取1 mL不同质量浓度的样品提取液，加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.6）、2.5 mL 10 g/L铁氰化钾溶液，50 ℃水浴反应20 min后加入2.5 mL 100 g/L三氯乙酸溶液充分混合，在3 000 r/min下离心10 min，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 1 g/L三氯化铁溶液，充分混匀，以70%甲醇溶液为空白，在700 nm波长处测定其吸光度以表示铁还原能力；以VC为对照，实验重复3 次。同时，对VC的铁还原能力作标准曲线，计算达到同等抗氧化效果时每克干样品相对于VC的质量（mg/g）。

1.3.5 超氧阴离子自由基清除能力测定

参照李斌[16]、张国强[17]等的方法略作改动，分别在试管中加入200 µL不同质量浓度的样品提取液、5.7 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.20）、0.1 mL 6 mmol/L邻苯三酚溶液，混合摇匀，25 ℃水浴反应6 min，在320 nm波长处测定其吸光度，记为Ai；以等体积的蒸馏水代替样品提取液测定吸光度，记为A0；以等体积的蒸馏水代替邻苯三酚溶液测定吸光度，记为At；以VC为对照，实验重复3 次，按照公式（2）计算超氧阴离子自由基清除率（Q）。

同时，对不同质量浓度的样品提取液和VC的超氧阴离子自由基清除率作标准曲线，计算样品的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）和达到同等抗氧化效果时每克干样品相当于VC的质量（mg/g）。

1.3.6 羟自由基清除能力的测定

参照延莎等[18]的方法略作改动。分别在试管中加入1 mL不同质量浓度的样品提取液、1 mL 10 mmol/L硫酸亚铁溶液、1 mL 10 mmol/L水杨酸溶液、1 mL 6 mmol/L过氧化氢溶液，37 ℃水浴反应30 min，迅速冷却，在510 nm波长处测定其吸光度，记为Ai；以等体积的蒸馏水代替样品提取液测定吸光度，记为A0；以等体积的蒸馏水代替过氧化氢溶液测定吸光度，记为At；以VC为对照，实验重复3 次，按照公式（2）计算羟自由基清除率（Q）。

1.3.7 DPPH自由基清除能力的测定

参照Jung等[19]的方法并稍作改动，以甲醇为溶剂制备0.1 mmol/L DPPH溶液。在试管内加入2 mL不同质量浓度的样品提取液和2 mL DPPH溶液，室温避光条件下充分反应30 min，以70%（体积分数，下同）甲醇溶液为空白，在517 nm波长处测定其吸光度，记为Ai；以等体积70%甲醇溶液代替样品提取液测定吸光度，记为A0；以等体积70%甲醇溶液代替DPPH溶液测定吸光度，记为At；以VC为对照，实验重复3 次，按照公式（2）计算DPPH自由基清除率（Q）。

1.3.8 ABTS阳离子自由基清除能力的测定

根据Yang Yao[7]、陈红梅[20]、Garzón[21]等的方法，将7 mmol/L ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液按体积比1∶1混合，避光放置16 h以生成ABTS阳离子自由基（ABTS溶液现用现配）。用甲醇稀释ABTS溶液（30 ℃贮存）以调节其在734 nm波长处的吸光度为0.70±0.02，记为A0；将3 mL ABTS溶液加入分别装有30 µL不同质量浓度样品提取液的试管中充分混匀，30 ℃避光反应6 min后在734 nm波长处测定其吸光度，记为Ai；以Trolox为对照，实验重复3 次，按照公式（3）计算ABTS阳离子自由基清除率。

同时，对不同质量浓度的样品提取液和Trolox对ABTS阳离子自由基清除率作标准曲线，计算样品的IC50和达到同等抗氧化效果时每克干样品相当于Trolox的质量（mg/g）。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 老山芹及其不同部位提取物的总多酚、总黄酮含量

从表1可以看出，老山芹全株植物、嫩叶、嫩茎提取物中总多酚含量均高于总黄酮，其中嫩茎提取物总多酚与总黄酮含量相差较大，总多酚是总黄酮含量的2.4 倍。嫩叶提取物总多酚含量是全株植物的1.25 倍、嫩茎的1.78 倍，且3 种样品间差异性显著（P＜0.05）。嫩茎提取物中总黄酮含量较低，仅为嫩叶的25%、全株植物的34%；嫩叶提取物总黄酮含量是全株植物的1.34 倍，且3 种样品之间差异显著（P＜0.05）。总地来说，3 种样品之间总多酚和总黄酮含量为嫩叶＞全株植物＞嫩茎。

表1 老山芹及其不同部位提取物总多酚和总黄酮含量Table 1 Total phenolics and total fl avonoids contents in different parts of Heraclenm dissectum

2.2 老山芹及其不同部位提取物的铁还原能力

图1 老山芹及其不同部位提取物的铁还原能力Fig. 1 Ferric reducing antioxidant power of extracts from different parts of Heraclenm dissectum

在铁还原能力中，吸光度越高证明其还原能力越强。从图1可知，3 种样品的铁还原能力均随着质量浓度的增大而升高。当质量浓度为60 μg/mL时，嫩茎与全株植物提取物的铁还原能力略低于对照组。当质量浓度为20、40、80 μg/mL时，全株植物与嫩茎提取物的铁还原能力存在显著性差异（P＜0.05），嫩叶提取物与对照组的铁还原能力差异不显著（P＞0.05），在此质量浓度下全株植物提取物的铁还原能力均为最大。当质量浓度为100、200 μg/mL时，全株植物、嫩叶、嫩茎提取物与对照组的铁还原能力差异显著（P＜0.05）。当质量浓度为100 μg/mL时，铁还原能力由大到小为嫩茎＞嫩叶＞全株植物；当质量浓度为200 μg/mL时，嫩叶提取物的铁还原能力明显高于全株植物与嫩茎提取物，是全株植物的1.37 倍、嫩茎的1.48 倍。

2.3 老山芹及其不同部位提取物的超氧阴离子自由基清除能力

由图2可知，在所有质量浓度下3 种样品提取物的超氧阴离子自由基清除能力均大于对照组，全株植物、嫩叶、嫩茎提取物与对照组的超氧阴离子自由基清除率差异显著（P＜0.05），且嫩叶提取物清除能力最强（除20.0 μg/mL组）。3 种样品提取物在20～60 μg/mL范围内超氧阴离子自由基清除率随着质量浓度的增大呈增大趋势，当质量浓度大于60 μg/mL时，嫩叶提取物超氧阴离子清除率基本保持在64%，而全株植物虽有增加但趋势不明显。对照组、嫩叶、全株植物、嫩茎提取物的IC50分别为189.70、25.52、60.40、65.38 μg/mL。相比于对照组，老山芹全株植物及其各部分提取物的超氧阴离子自由基清除率都较高，说明其具有较高的超氧阴离子自由基清除能力。

图2 老山芹及其不同部位提取物的超氧阴离子自由基清除能力Fig. 2 Superoxide anion radical scavenging activity of extracts from different parts of Heraclenm dissectum

2.4 老山芹及其不同部位提取物的羟自由基清除能力

图3 老山芹及其不同部位提取物的羟自由基清除能力Fig. 3 Hydroxyl radical scavenging activity of extracts from different parts of Heraclenm dissectum

从图3可以看出，老山芹全株植物及不同部位提取物的羟自由基清除能力随着样品质量浓度的增加而增强。当样品质量浓度为200 μg/mL时，老山芹全株植物、嫩叶、嫩茎提取物和对照组的羟自由基清除率分别为60%、66%、54%、53%，明显高于其他质量浓度，这是因为在此质量浓度下3 种提取物中多酚含量达到饱和状态，与羟自由基充分反应；根据化学反应动力学原理，在低质量浓度范围羟自由基清除率与样品质量浓度成正比，当增加至较大质量浓度（200 μg/mL）时，虽然羟自由基清除率的增长速率较慢，但最终的清除率明显高于其他质量浓度。当质量浓度为20、80、100 μg/mL时，嫩茎提取物的羟自由基清除率低于对照组。全株植物、嫩叶、嫩茎提取物与对照组的羟自由基清除率在80～200 μg/mL时差异显著（P＜0.05），且嫩叶提取物的羟自由基清除能力均大于全株植物。总体上羟自由基清除能力大小为嫩叶＞全株植物＞嫩茎。老山芹全株植物、嫩叶、嫩茎提取物和对照组的IC50分别为164.64、144.69、180.78、184.50 μg/mL，说明老山芹全株植物和嫩叶提取物对羟自由基的清除能力强于对照组，嫩茎提取物对羟自由基的清除能力相对较弱。

2.5 老山芹及其不同部位提取物的DPPH自由基清除能力

图4 老山芹及其不同部位提取物的DPPH自由基清除能力Fig. 4 DPPH radical scavenging activity of extracts from different parts of Heraclenm dissectum

从图4可以看出，除全株植物、嫩茎提取物在10 μg/mL时的DPPH自由基清除率低于对照组外，3 种样品提取物的DPPH自由基清除率均大于对照组。对照组、全株植物、嫩叶、嫩茎提取物在质量浓度为100 μg/mL时的DPPH自由基清除率分别为80.61%、86.50%、88.10%、87.16%，全株植物与嫩叶提取物之间的DPPH自由基清除率差异显著（P＜0.05）。在低质量浓度（20、40 μg/mL）时，嫩叶、嫩茎提取物与对照组的DPPH自由基清除率差异性显著（P＜0.05）。总的来说，嫩叶提取物的DPPH自由基清除能力优于嫩茎与全株植物。老山芹全株植物、嫩叶、嫩茎提取物、对照组的IC50分别为25.86、4.90、19.17、24.84 μg/mL。综上所述，老山芹全株植物及其各部位提取物的DPPH自由基清除能力由高到低为嫩叶＞嫩茎＞全株植物。

2.6 老山芹及其不同部位提取物的ABTS阳离子自由基清除能力

图5 老山芹及其不同部位提取物的ABTS阳离子自由基清除能力Fig. 5 ABTS radical scavenging activity of extracts from different parts of Heraclenm dissectum

从图5可以看出，老山芹全株植物及其不同部位甲醇提取物的ABTS阳离子自由基清除率随着样品质量浓度的增大而增大，且嫩叶提取物在各个质量浓度的ABTS阳离子自由基清除率均最大。当质量浓度为200 μg/mL时，嫩叶和全株植物提取物的ABTS阳离子自由基清除率分别为75.33%、67.40%，大于Trolox（67.10%），而嫩茎提取物仅为53.14%。在低质量浓度（20、40 μg/mL）下，3 种样品提取物之间的ABTS阳离子自由基清除率差异显著（P＜0.05），大小为嫩叶＞嫩茎＞Trolox＞全株植物。当质量浓度为60、80 μg/mL时，全株植物与嫩茎提取物的ABTS阳离子自由基清除率差异不显著（P＞0.05），3 种样品ABTS阳离子自由基清除率均大于对照组。老山芹全株植物、嫩叶、嫩茎提取物的IC50分别为129.45、104.13、163.49 μg/mL，而Trolox为129.57 μg/mL。综上所述，老山芹嫩叶提取物对ABTS阳离子自由基清除能力强于对照组，而全株植物与嫩茎提取物相对于对照组较弱。

2.7 老山芹及其不同部位提取物的体外抗氧化能力

表2 老山芹及其不同部位甲醇提取物体外抗氧化能力Table 2 Analysis of antioxidant capability of methanol extracts from different parts of Heraclenm dissectum

从表2可知，老山芹全株植物、嫩叶与嫩茎提取物的5 种抗氧化能力之间差异显著（P＜0.05），3 种样品在超氧阴离子自由基、羟自由基、ABTS阳离子自由基清除能力中分别具有显著性差异（P＜0.05），但DPPH自由基清除能力较为相似。结果表明老山芹嫩叶的体外抗氧化能力最强，嫩茎的抗氧化能力相对较弱。

3 讨 论

植物所具有的抗氧化活性并不是植物中某种单一化合物作用的结果，而是由植物中多种酚类物质共同作用的结果，并且抗氧化能力的大小与酚类物质的含量密切相关[22-23]。植物不同部位的多酚物质含量与组成均不相同，显示出不同的抗氧化活性[24-30]。

本研究考察了老山芹全株及其不同部位甲醇提取物的总多酚、总黄酮含量及体外抗氧化能力。老山芹全株植物、嫩茎、嫩叶在铁还原能力和超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力的测定中表现了较好的抗氧化活性，且具有较大的差异性。结果表明老山芹嫩叶的抗氧化能力优于全株植物与嫩茎。全株植物除对DPPH自由基的清除能力较弱外，对ABTS阳离子自由基等其他4 种自由基的清除能力均强于嫩茎，这一现象可能是因为全株植物中所含的化学物质之间的协同作用抑制了对DPPH自由基的清除，具体原因在进一步分析老山芹植物体中的酚类物质组成和抗氧化成分的一级结构后才能得出。同时，老山芹全株植物、嫩叶、嫩茎提取物的5 种抗氧化指标虽然分别随着质量浓度的增大而增大，但三者抗氧化能力的排序随样品质量浓度的变化而变化，这一现象可能是由于在不同质量浓度下老山芹全株植物、嫩叶、嫩茎这3 种样品提取物之间分别具有不同的抗氧化能力，且3 种提取物与底物反应的程度均不相同，所以在实验中可以看到3 种样品间抗氧化能力的排序存在些许波动。

老山芹全株植物和嫩叶中含有丰富的酚类物质，具有良好的抗氧性，是一种天然的抗氧化剂。因此，未来针对老山芹抗氧化这一功能特性，开发相关保健食品具有良好的市场与经济前景。为了更好地利用这一资源丰富、发展前景好的林下资源，研究老山芹酚类物质的组成与结构，测定各酚类物质的含量，优化多酚物质的提取工艺，了解老山芹中酚类物质的协同、拮抗作用与抗氧化活性之间的相关性是未来的研究热点。