正交实验法优化超声-微波协同提取枸杞中总黄酮的工艺研究

王琳琳，尚冀宁，徐丽娟

（银川能源学院石油化工系，宁夏银川750100）

枸杞是宁夏地区名贵中药材和重要经济作物，具有滋肝补肾、益精明目的功效[1]。枸杞一直被广泛应用于调节免疫力、预防和降低心脑血管疾病发病率、保护肝脏、抗衰老等领域[2]。枸杞的化学成分主要为枸杞多糖、甜菜碱、色素、维生素和黄酮类化合物等活性成分[3-4]。其中，枸杞中的黄酮类化合物具有止咳、平喘、祛痰等功效[5-6]，并且具有降低胆固醇、扩张血管、增强心脏收缩能力、减少心脏搏动次数和清除身体自由基等作用，从而引起了国内外的广泛关注[7-10]。目前对黄酮类化合物的提取方法最主要为溶剂回流提取法[11-12]、超声波提取法[13-16]和微波提取法[17-19]。而超声-微波协同提取法提取枸杞中的总黄酮目前尚未报道。超声-微波协同提取法是在超声波提取和微波提取基础上发展的一种新型提取方法，它兼顾超声波和微波的优点，同时又弥补各自的不足，提取过程中利用超声波产生的强烈空化效应和微波的高选择性等作用，可使植物细胞中的有效成分快速进入溶剂，提高有效成分的提取率，有效缩短提取时间，并且避免高温对活性成分的破坏，因此超声-微波协同提取技术被广泛应用于提取植物中的生物碱、多糖、黄酮类等生物活性物质[20-23]。

通过超声-微波协同提取技术对枸杞中总黄酮进行提取，在单因素实验的基础上结合正交实验优化提取条件，得出超声-微波提取枸杞中总黄酮的最佳提取工艺条件，并在此条件下比较乙醇回流法、超声波提取法、微波提取法和超声-微波协同提取法对枸杞总黄酮的提取率，为更好地开发利用枸杞中黄酮类物质提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：枸杞，宁夏百润源生物食品有限公司。

试剂及耗材：芦丁标准品，中国药品生物制品检定所；无水乙醇（分析纯）；亚硝酸钠（分析纯）；硝酸铝（分析纯）；氢氧化钠（分析纯）；CW-2000型超声-微波协同提取仪，上海新拓测试技术有限公司；电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；UT-1950紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；DHG-9071型电热恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；SHZ-DCⅢ循环水式真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 枸杞中总黄酮的提取

将枸杞在50℃下烘干，粉碎后过50目筛；称取过筛后样品10 g，加入乙醇溶剂，置于超声-微波协同提取仪中提取，抽滤、滤液为总黄酮提取液。

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制

精确称取干燥至恒重的芦丁标准品0.020 g，用65%的乙醇溶解，并定容于100.00 mL的容量瓶中。分别移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL置于25.00 mL容量瓶中，依次加入65%的乙醇5 mL，6%的NaNO2溶液1 mL，摇匀静置6 min，再加入10%的Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀静置6 min；再加入6%的NaOH溶液5 mL，用65%的乙醇定容至25.00 mL，摇匀静置15 min。在510 nm处测定其吸光度。线性回归方程为：A=25.963C-0.00609，R2=0.99995，在0.008～0.048 mg/mL范围内呈良好线性关系。

1.2.3 总黄酮提取率的计算

精确移取5.0 mL总黄酮提取液置于25.00 mL容量瓶中，参照“1.2.2”进行定容，测定吸光度，根据公式（1）计算出总黄酮提取率。提取率公式为：

式中：25——测定时定容体积，mL；

V——总黄酮提取液总体积，mL；

5——测定时移取的总黄酮的体积，mL；

10000——枸杞粉末质量，mg；

A——吸光度；

0.00609 、25.963——芦丁标准曲线系数。

1.2.4 超声-微波提取法提取枸杞中总黄酮单因素实验

分别设置提取功率为200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W，提取温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%、100%，料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，提取时间为10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min条件下进行枸杞中总黄酮提取，考查提取功率、提取温度、乙醇浓度、料液比和提取时间对提取率的影响。

1.2.5 正交实验

在单因素实验的基础上，对影响提取率的4个主要因素，每个因素3个水平，进行L9(34)正交实验(表1)，优化最佳提取条件。

表1 正交实验因素水平设计

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

按照方法“1.2.2”在510 nm下测芦丁对照品的吸光度，并以吸光度（A）为纵坐标，芦丁浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，见图1。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素实验

2.2.1 提取功率对总黄酮提取率的影响（图2）

图2 提取功率对总黄酮提取率的影响

由图2可知，随着提取功率增大，总黄酮提取率也在增大，当功率为300 W时，提取率达到最大值，之后随着功率增加，提取率出现下降趋势。这种变化趋势可能由以下原因所导致：第一，超声波对植物细胞有破坏作用，功率小于300 W时，总黄酮有效成分溶解速度加快，故提取率增大，大于300 W后功率继续增大，对细胞的破坏作用也增大，细胞中的杂质溶解量也相应增加，导致提取率下降；第二，微波功率增大使溶液温度升高，当功率为350 W时，测得溶液温度为65℃，使总黄酮中的活性成分结构被破坏而使提取率下降。因此最佳提取功率为300 W。

2.2.2 提取温度对总黄酮提取率的影响（图3）

图3 提取温度对总黄酮提取率的影响

由图3可知，随着提取温度不断上升，总黄酮提取率也在逐渐上升。当提取温度达到50℃时，提取率开始下降，超过50℃后，温度升高使总黄酮中的某些不耐高温的化合物的结构被破坏而使提取率下降，故最佳提取温度为50℃。

2.2.3 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响（图4）

图4 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

由图4可知，随着乙醇浓度的增大，总黄酮提取率随之上升，当乙醇浓度为70%时，提取率最高，说明提取效果最好；之后随着乙醇浓度进一步增大，提取率呈下降趋势。原因可能为黄酮类化合物结构决定其具有较高极性，而不同浓度的乙醇溶剂极性不同。根据相似相溶原理，乙醇浓度为70%时与枸杞总黄酮的极性最相似，故对黄酮类化合物溶解性最强，因此最佳浓度为70%。

图5 料液比对总黄酮提取率的影响

2.2.4 料液比对总黄酮提取率的影响（图5）由图5可知，随着料液比的增大，提取率也随之增大，当料液比达到1∶25时，提取率达到最大值，之后随着料液比增大，提取率趋于平缓。因为随着料液比的增大，枸杞粉末与溶剂接触面增加，

黄酮类化合物越容易被提取出来；当料液比增大到一定值后，一定量的枸杞中总黄酮含量完全被提取出来，故提取率趋于平缓；而且，液料比增大，溶剂用量会增加，导致提取成本增高，同时也增加溶剂回收难度，使操作时间延长。因此，确定最佳料液比为1∶25。

图6 提取时间对总黄酮提取率的影响

2.2.5 提取时间对总黄酮提取率的影响（图6）由图6可知，随着时间的延长，提取率也上升。当提取时间达到25 min时，继续延长时间，提取率有所下降，这表明提取时间达到25 min时，枸杞中的总黄酮已完全被提取出来，继续增加提取时间，会使已提取的总黄酮部分被氧化，导致提取率下降。故最佳提取时间为25 min。

2.3 正交实验及结果分析

L9(34)正交实验结果见表2。由表2可知，各因素对总黄酮提取率影响的主次顺序为：提取温度(A)＞料液比(C)＞乙醇浓度(B)＞提取时间(D)，比较各因素的极差R可知，提取温度(A)和料液比(C)的极差较大，说明这两个因素对提取率影响较显著；而乙醇浓度(B)和提取时间(D)的极差较小，说明这两个因素对提取率影响较小。通过分析可以确定超声-微波协同提取的最佳提取条件为A2B1C2D2，即提取温度50 ℃，料液比为1∶20，乙醇浓度为60%，提取时间20 min。

表2 L9(34)正交实验结果

2.4 验证实验

将优化后的最佳提取条件重复实验3次进行验证实验，计算总黄酮的提取率，结果见表3。

表3 验证结果

由表3可知，最佳提取条件所得到3组平均提取率为1.98%，RSD为0.35%，重现性较好，工艺条件合理。

2.5 方法对比

通过上述实验及其结果分析，在最佳工艺条件下，分别采用乙醇回流法、超声波提取法、微波提取法和超声-微波协同提取法提取枸杞中的总黄酮，并比较提取率，结果见图2—图6。对比结果见图7。

由图7可知，对4种提取方法进行对比，得出超声-微波协同提取法的提取率最高，达到1.98%。

图7 不同提取方法的总黄酮提取率

3 结论

以枸杞总黄酮提取率为考查标准，采用超声-微波提取法提取枸杞中的总黄酮。并采用正交实验法优化提取工艺得到最佳提取条件。最佳提取条件为：提取功率300 W，提取温度50℃，乙醇浓度60%，料液比1∶20，提取时间20 min；由此条件的验证实验得出提取率为1.98%。并在最佳条件下比较4种提取方法的提取率，得出超声-微波协同提取法总黄酮提取率最高。该实验结果为高效合理开发枸杞中的活性成分提供了一定的理论基础。