长春地区幽门螺杆菌分离株对常用抗菌药物耐药性的分析*

范聪聪 赵春燕 江海洋 铁丹丹 赵亚楠 王丽波

吉林大学基础医学院病原生物学系1(130021) 吉林大学白求恩第一医院小儿消化内科2

背景：由于临床上抗菌药物的不合理使用，幽门螺杆菌(Hp)的耐药率呈逐年上升的趋势。不同地区的Hp耐药率存在巨大差异。目的：分析长春地区Hp对七种常用抗菌药物的耐药情况，为临床上选择抗菌药物根除Hp感染提供一定的理论指导。方法：收集2014年9月—2017年10月吉林大学白求恩第一医院的298例行胃镜检查患者的黏膜标本，分离并鉴定Hp，并用琼脂稀释法对Hp进行药敏试验。结果：从298例胃黏膜标本中成功分离出69株Hp菌株，阳性率为23.1%。69株菌株中，克拉霉素的耐药率最高(52.2%)，阿莫西林的耐药率最低(5.8%)。17株(24.6%)菌株对七种抗菌药物均敏感，16株(23.2%)菌株对一种抗菌药物耐药，36株(52.2%)菌株对两种及以上抗菌药物耐药。结论：本地区Hp对克拉霉素、硝唑类药物均有较高的耐药性，推荐阿莫西林作为根除Hp感染的药物。

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, Hp)是导致慢性胃炎、消化性溃疡甚至胃癌的主要致病菌[1]。全球约一半人口伴有Hp感染，部分发展中国家的感染率达80%以上[2-4]。目前，我国Hp感染处理共识报告推荐使用由质子泵抑制剂(PPI)、铋剂联合两种抗菌药物组成的含铋剂四联疗法对Hp进行根除治疗[5]。但由于临床上抗菌药物的不合理使用，Hp的耐药率呈逐年上升的趋势。Hp耐药率在不同地区有巨大的差异，耐药菌株的产生以及耐药率的逐年增长为Hp的根除带来一定困难。因此，推荐根据药敏试验结果选择根除Hp的抗菌药物，有望提高其根除率。临床常用的Hp一线抗菌药物包括阿莫西林、甲硝唑和克拉霉素，二线抗菌药物包括呋喃唑酮、左氧氟沙星、四环素和替硝唑。本研究通过测定上述7种抗菌药物对本地区分离的69株Hp菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibition concentration, MIC)，旨在初步了解本地区Hp耐药状况并确定敏感抗菌药物，从而提高Hp根除率。

材料与方法

一、组织来源

选取2014年9月—2017年10月于吉林大学白求恩第一医院行胃镜检査者(包括慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌等)的胃部黏膜组织。纳入标准：出现上腹部疼痛或有烧灼感，上腹饱胀感并伴有恶心，呕吐反酸或食欲不振等症状。排除标准：①接受过相应抗菌药物治疗者；②妊娠期、哺乳期患者；③有严重精神疾病不能合作者；④有严重肝病、心脏病、恶性肿瘤或呼吸系统疾病者。本研究方案由吉林大学白求恩第一医院伦理委员会审批通过，并取得患者的知情同意。

二、主要试剂

哥伦比亚琼脂和Karmali弯曲杆菌琼脂(英国OXOID公司)，脱纤维羊血和胎牛血清(南京茂捷微生物科技有限公司)，微需氧产气袋(日本三菱化学株式会社)，N，N-二甲基甲酰胺、七种抗菌药物阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、呋喃唑酮、甲硝唑、替硝唑、四环素(北京索莱宝科技有限公司)。

三、方法

1. Hp的分离鉴定：取胃窦部组织2～3块，充分剪碎研磨后接种于10% Karmali血琼脂平板上进行分离培养。将培养平板放入厌氧罐内，加入适量无菌蒸馏水以及微需氧产气袋，37 ℃培养箱内培养4～5 d。将疑似Hp的菌落进行纯培养后，给予生物学鉴定(革兰染色镜检、快速尿素酶试验、氧化酶实验、触酶实验)和分子生物学鉴定(尿素酶A基因和16S rRNA基因鉴定等)，结果均为阳性的菌株判定为Hp阳性。

2. 制备不同浓度抗菌药物的哥伦比亚血平板：分别将不同浓度的七种抗菌药物溶液加入含有15%新鲜血液的哥伦比亚琼脂培养基中，配成终浓度分别为0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL和128 μg/mL的药物培养基平板，4 ℃储存备用。

3. 药敏试验：用无菌0.9% NaCl溶液将菌株浓度调整至1.5×108CFU/mL。吸取1～2 μL菌液，分别均匀地接种于上述含不同浓度的七种抗菌药物的哥伦比亚血平板上，以无抗菌药物的血琼脂平板以及质控菌株NCTC11637作为阴性对照。全部接种完后将平板倒置于厌氧罐中，加入微需氧产气袋和适量无菌双蒸水，37 ℃培养箱中培养5 d4后观察结果。以不包含细菌的抗菌药物最高浓度作为MIC。

根据美国临床试验标准委员会(NCCSL)制定的标准，七种抗菌药物的耐药临界值分别为阿莫西林8 μg/mL、甲硝唑8 μg/mL、克拉霉素1 μg/mL、呋喃唑酮2 μg/mL、左氧氟沙星2 μg/mL、替硝唑8 μg/mL、四环素2 μg/mL。

结 果

一、Hp菌株的分离培养

在研究期间共收集了298例胃部黏膜组织标本，其中男性165例，女性133例；年龄19～85岁，平均(53.9±10.2)岁。共成功分离出69株Hp菌株，阳性率为23.2%。根据病理检查结果，消化性溃疡(胃溃疡和十二指肠溃疡)分离菌株29株，非溃疡性消化不良(包括十二指肠炎、非萎缩性胃炎、萎缩性胃炎以及糜烂性胃炎等)分离菌株29株，胃癌分离菌株11株。

二、Hp对七种抗菌药物的耐药率

69株菌株中，36株菌株对克拉霉素耐药，耐药率为52.2%，明显高于其他6种抗菌药物的耐药率。硝唑类药物如甲硝唑和替硝唑的耐药率也相对较高，分别为30.4%和47.8%。阿莫西林的耐药率最低，为5.8%(表1)。说明阿莫西林可继续作为Hp的一线抗菌药物。

三、七种抗菌药物的MIC结果分析

克拉霉素的MIC为0.25～32 μg/mL，多集中于0.25～1 μg/mL；阿莫西林和左氧氟沙星的MIC多集中于0.25～2 μg/mL；甲硝唑、四环素和呋喃唑酮的MIC多集中于0.25～1 μg/mL；替硝唑的MIC多集中于0.25～32 μg/mL(表2、图1～2)。

表1 69株Hp菌株对七种抗菌药物的MIC和耐药率情况

表2 七种抗菌药物对69株Hp菌株的MIC分布 (n)

图1 一线抗菌药物对69株Hp菌株的MIC分布

图2 二线抗菌药物对69株Hp菌株的MIC分布

四、Hp菌株的多重耐药性

69株Hp菌株中，17株(24.6%)对七种抗菌药物均敏感；16株(23.2%)对一种抗菌药物耐药，其中5株(31.3%)仅对克拉霉素耐药，6株(37.5%)仅对替硝唑耐药，2株(12.5%)仅对左氧氟沙星耐药，2株(12.5%)仅对呋喃唑酮耐药，1株(6.3%)仅对阿莫西林耐药，未发现对四环素和甲硝唑单独耐药的菌株；36株(52.2%)对两种及以上抗菌药物耐药。

讨 论

本研究显示，从吉林长春地区分离的Hp菌株对克拉霉素的耐药率为52.2%，明显高于其他6种抗菌药物的耐药率，菌株的MIC为0.25～32 μg/mL，而MIC50为1 μg/mL，故在本地区应用克拉霉素时应基于药敏试验结果合理使用。一线抗菌药物甲硝唑的耐药率为30.4%，低于全国平均水平67.2%，MIC多集中于0.25～1 μg/mL，说明在对甲硝唑敏感的菌株中，其抑菌活性仍较高。阿莫西林的耐药率最低，仅为5.8%，菌株的MIC为0.25～2 μg/mL。因此，阿莫西林可继续作为根除Hp的一线抗菌药物。同时本地区出现了多重耐药菌株，多重耐药率占52.2%。多重耐药菌株的出现导致临床选择抗菌药物存在极大的困难，从而影响Hp的根除效果。

据报道，北京地区2008—2014年间克拉霉素的耐药率已从37%上升至52%，甲硝唑耐药率保持在68%左右[6]。2010—2013年浙江嘉兴地区甲硝唑耐药率均为100%，克拉霉素耐药率已上升至30.9%[7]。Kuo等[8]分析发现，亚太地区Hp的耐药率呈上升趋势，克拉霉素的平均耐药率为17%，甲硝唑为44%，左氧氟沙星为18%，阿莫西林和四环素的耐药率约为4%。由于抗菌药物的滥用，我国各地区Hp耐药率均已远超平均水平。Kobayashi等[9]发现日本克拉霉素的耐药率从2002年的18.9%升至2005年的27.7%；而甲硝唑耐药率变化不大，为3.3%～5.3%。一项纳入18个欧洲国家2 204 例患者的研究[10]结果显示，欧洲地区Hp对克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐药率分别为17.5%、34.9%和14.1%。其中甲硝唑的耐药率与本研究结果相当。阿莫西林的耐药率几乎可忽略不计。Hp的耐药性存在较大的区域差异，因此在选择抗菌药物时，应针对患者和当地耐药监测结果制定有效的抗菌药物治疗策略，可减少抗菌药物的耐药性，进而减少治疗失败。

Hp对抗菌药物耐药是影响当前根除方案疗效的主要因素[11]。不同区域的细菌耐药率不同，一般与人群中抗菌药物的使用习惯密切相关[12-13]。日本一项研究[14]发现，在1993—2000年期间，克拉霉素的使用率及其耐药率增加了四倍。与此相反，在过去的数十年中，英国、荷兰、挪威等欧洲国家谨慎使用抗菌药物，Hp的耐药率较低，而葡萄牙、匈牙利等国家的克拉霉素耐药率却明显增高[10,15-16]。欧洲Hp处理指南建议，一线治疗方案应根据克拉霉素和甲硝唑的耐药率来调整，若克拉霉素耐药率>15%～20%或甲硝唑耐药率>40%，应选择阿莫西林来根除Hp[17]。因此，检测Hp对这些常用抗菌药物的耐药率对Hp的根除是至关重要的，以便在临床实践中选择最适合的抗菌药物。

总之，本研究结果显示本地区Hp对克拉霉素、硝唑类药物均有较高的耐药性，推荐阿莫西林作为根除Hp感染的药物。