ABCG2在非小细胞肺癌吉非替尼耐药中的作用研究

王雷 王明吉 黄磊 代璐璐 李颜君 郑玉军

[摘要]目的 研究ATP结合膜转运蛋白超家族G成员2（ABCG2）在非小细胞肺癌吉非替尼耐药中的作用，对吉非替尼耐药的非小细胞肺癌治疗提供依据。方法 培养人肺腺癌吉非替尼敏感细胞株A549及吉非替尼耐药的人肺腺癌细胞系A549/GR，A549/GR细胞的耐药性检测应用MTT法。用蛋白质印迹法（Western Blot）检测被吉非替尼作用的A549/GR细胞及A549细胞中的ABCG2、p-AKT蛋白的表达情况。分别加入磷醇酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）通路激活剂胰岛素样生长因子-1（IGF-1）及抑制剂LY294002，分析作用于上述两种细胞的p-AKT、ABCG2蛋白表达情况。应用流式细胞仪测定A549及A549/GR细胞株中的ABCG2外排情况。收集2015年4月～2017年4月我院收治的非小细胞肺癌患者及健康人血清，分为非小细胞肺癌非耐药组（20例）、非小细胞肺癌吉非替尼耐药组（20例）和健康者组（20例）。应用ELISA法检测三组的ABCG2表达。结果 随着剂量的增加，吉非替尼对A549细胞及A549/GR细胞的抑制作用均增强（P<0.05）。A549/GR的耐药指数为13.4。Western Blot检测耐药相关蛋白，结果显示，耐药细胞A549/GR中的ABCG2和p-AKT均高于亲代细胞A549。IGF-1作用的A549细胞，p-AKT、ABCG2蛋白表达均提高（P<0.05）。LY294002作用A549/GR细胞，p-AKT、ABCG2均下调（P<0.05）。IGF-1作用A549细胞后，较未加入激活剂的A549细胞，其外排作用增强（P<0.05）。LY294002作用A549/GR细胞后，较未加入激活剂的A549/GR细胞，其外排作用减少（P<0.05）。健康人的ABCG2表达明显低于非小细胞肺癌非耐药组患者（P<0.05），非小细胞肺癌吉非替尼耐药组患者的ABCG2表达均高于非小细胞肺癌非耐药组患者及健康人（P<0.05）。结论 在非小细胞肺癌吉非替尼耐药中ABCG2起到了重要的作用，逆转ABCG2介导的NSCLC靶向耐药主要通过调节PI3K/AKT信号通路。

[关键词] ATP结合膜转运蛋白超家族G成员2;非小细胞肺癌;吉非替尼;耐药;磷醇酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶

[中图分类号] R979.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）3（b）-0009-05

肺癌是近年来发病率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-samll cell lung cancer，NSCLC）占80%～90%[1-2]。吉非替尼是第一代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosinekinase inhibitor，EGFR-TKI）类药物，是治疗晚期NSCLC EGFR突变人群的首要选择，但治疗后大部分患者会产生获得性耐药[3-4]。ATP结合膜转运蛋白超家族G成员2（ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2）通过外排泵作用，促进细胞内化疗药物主动外排，参与多种肿瘤耐药机制[5-6]。既往研究表明[7-8]，耐厄洛替尼的人肺腺癌细胞株（A549/ER）相对于A549细胞株ABCG2表达升高，由于厄洛替尼与吉非替尼均属于EGFR-TKI类药物，但其药理学特性不同，所以吉非替尼的耐药亦可能与ABCG2有关。本课题通过对ABCG2在NSCLC吉非替尼耐药中的作用及其介导耐药的信号路径的研究，对于吉非替尼耐药的NSCLC的治疗有重要意义，现报道如下。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞材料  人非小细胞肺腺癌吉非替尼敏感细胞株A549购自上海复祥生物科技有限公司，吉非替尼耐药非小细胞肺癌细胞株A549/GR由本实验室诱导所得。

1.1.2 一般资料  收集2015年4月～2017年4月我院收治的NSCLC患者及健康人的血清，分为NSCLC非耐药组（20例）、NSCLC吉非替尼耐药组（20例）和健康者组（20例）。NSCLC非耐药组研究对象的年龄39～80岁;男7例，女13例;腺癌17例，鳞癌2例，腺鳞癌1例。NSCLC吉非替尼耐药组研究对象的年龄43～76岁;男5例，女15例;腺癌19例，腺鳞癌1例。健康者组研究对象的年龄31～75岁，男9例，女11例。三组的一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会审核及同意。

1.1.3药品与试剂  吉非替尼购自阿斯利康公司（250 mg/片）。一抗：GAPDH（武汉博士德公司）;ABCG2（Abcam公司）;p-AKT（Abcam公司）;二抗：辣根过氧化物酶（汉博士德公司）;PRMI1640培养基及胎牛血（Hyclone公司）;MTT（Sigma公司）;ABCG2酶联免疫分析试剂盒（cusabio公司）。Thermo Multikan MK3酶标仪（Thermo公司）。

1.2方法

1.2.1细胞培养  将A549细胞株应用含10%胎牛血清的PRMI1640于37℃、5% CO2的培养箱中进行养育。将A549/GR细胞株置于含有浓度为1 μmol/L吉非替尼的10%胎牛血清的PRMI1640，于37℃、5% CO2培养箱中培养，实验对象為对数生长期细胞。

1.2.2 A549/GR细胞的耐药性检测  将A549及A549/GR细胞分别加入100 μl呈半数药物浓度梯度的培养基，各设置7个浓度梯度组（0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）及空白对照组，培养后加入MTT，浓度5 mg/ml，培养4 h后，吸出培养基，加入150 μl二甲基亚砜（DMSO），轻微振荡后用酶标仪检测吸光度（A）值（波长490 nm）。用下列公式进行计算：

细胞存活率=（实验组A值/对照组A值）×100%，耐药指数=耐药细胞半抑制浓度（IC50）/亲代细胞IC50

1.2.3 ABCG2、p-AKT蛋白在A549、A549/GR细胞的表达  用吉非替尼分别处理A549、A549/GR，细胞裂解后，提取总蛋白，应用BCA法行蛋白定量。在120 V下持续电泳至样品到达凝胶底部。半干转膜仪转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，洗膜后，剪下相应条带，分别放入GAPDH、ABCG2、p-AKT多克隆一抗中（1∶1000稀释），4℃冰箱孵育过夜。次日，将PVDF膜从一抗中取出，洗膜缓冲液（TBST）洗脱3次，置于二抗（1∶2000稀释）中，于摇床上摇动，洗脱3次。最后将配好的电化学发光（ECL）液滴加覆盖PVDF膜。使用超灵敏化学发光仪进行曝光，选择合适曝光时间，观察分析曝光的条带情况。

用浓度为100 ng/ml的胰岛素样生长因子-1（IGF-1）及浓度为20 μmol/L的LY294002分别处理A549、A549/GR细胞48 h，用上述同样方法检测蛋白的表达。

1.2.4检测细胞中ABCG2外排  取A549细胞及A549/GR细胞作为对照，在A549细胞和A549/GR细胞中分别加入IGF-1、LY294002，将4组细胞各加入1 μg/ml Rh123培养24 h，使用流式细胞仪检测ABCG2外排情况。

1.2.5检测健康人、NSCLC非耐药组及非小细胞肺癌吉非替尼耐药组患者中ABCG2表达  收集患者清晨空腹静脉血，静置取上层血清，按酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒操作说明，进行ELISA检测血清中ABCG2水平。

1.3统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±標准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组建比较采用单因素方差分析;计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 A549/GR细胞的耐药性检测

吉非替尼对A549细胞及A549/GR细胞的抑制作用，随浓度的升高而增强（P<0.05）。浓度相同，A549/GR的细胞存活率高于A549细胞（图1）。吉非替尼对A549/GR的IC50为47 μmol/L，吉非替尼对A549细胞的IC50为3.5 μmol/L，耐药指数为13.4。

与同组前一个浓度比较，*P<0.05

2.2 ABCG2、p-AKT蛋白在A549、A549/GR细胞的表达

Western Blot检测耐药相关蛋白，结果显示，耐药细胞A549/GR中的ABCG2和p-AKT均高于亲代细胞A549（图2）。

IGF-1作用的A549细胞、p-AKT、ABCG2蛋白表达提高（P<0.05）。LY294002作用A549/GR细胞、p-AKT、ABCG2均下调（P<0.05）（图3）。

2.3检测细胞中ABCG2外排

IGF-1作用A549细胞后，较未加入激活剂的A549细胞，其外排作用增强（P<0.05）。LY294002作用A549/GR细胞后，较未加入激活剂的A549/GR细胞，其外排作用减少（P<0.05）（图4）。

2.4检测健康人、NSCLC非耐药组及NSCLC吉非替尼耐药组患者中ABCG2表达

检测健康人、NSCLC非耐药组及NSCLC吉非替尼耐药组患者的ABCG2表达分别为（98.6±6.8）ng/ml、（209.5±8.2）ng/ml及（326.7±10.3）ng/ml。健康人的ABCG2表达明显低于NSCLC非耐药组患者（P<0.05），NSCLC吉非替尼耐药组患者的ABCG2表达均高于NSCLC非耐药组患者及健康人（P<0.05）。

3讨论

EGFR-TKI是目前晚期NSCLC EGFR突变患者的一线治疗选择，其耐药机制已成为临床研究的重点。早在1970年Biedler等[9]就首次报道肿瘤存在多药耐药（multidrug resistance，MDR）现象。癌细胞多药耐药性形成的重要原因是ABC转运体的异常表达[10-11]。人类基因组编码ABC转运体有49个，包括A～G 7个亚家族，其中最少有16个转运体已被证实具有药物外排功能[12]。ABCG2属于ABC转运体家族中的一员，最早是在乳腺癌耐药细胞株中被发现，是一种半转运体[13]。有研究证实ABCG2与吉非替尼、厄洛替尼等相结合可导致药物主动外排到胞外，进而抑制其生物活性，产生耐药[14-15]。本研究着重于探讨ABCG2 在吉非替尼耐药的非小细胞肺癌中作用及其调控耐药的机制。

Ho等[16]从H460、H23、HTB-58、A549、H441、H2170六种肺癌细胞系中分离出的侧群细胞中ABCG2高表达。一项中国台湾的研究显示[17]，对于吉非替尼耐药的EGFR野生型的非小细胞肺癌中，其耐药与ABCG2相关，而且ABCG2表达过多可提示对吉非替尼的疗效差。本研究结果提示，Western Blot检测耐药相关蛋白，耐药细胞A549/GR中的ABCG2和p-AKT均高于亲代细胞A549，证明了耐药细胞中ABCG2的表达要明显高于正常肿瘤细胞（P<0.05）。与以上研究基本一致，但本课题缺乏对ABCG2影响肿瘤治疗预后的研究，有待进一步的研究。

磷醇酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（phpsphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT）通路激活剂IGF-1可在体外激活PI3K/AKT信号通路，激活AKT活化，进而调控肿瘤细胞的生长、增殖，促进血管生成，提高肿瘤细胞的侵袭、转移能力[18-19]。PI3K/AKT通路抑制剂LY294002为一种高效的AKT激酶选择性抑制剂，可使吉非替尼耐药的非小细胞肺癌细胞株逆转耐药[20]。本研究利用加入PI3K/AKT通路激活剂和抑制剂的细胞通过RH123外排的检测来明确ABCG2外排情况。研究结果提示，IGF-1作用的A549细胞，p-AKT、ABCG2蛋白表达均提高（P<0.05）。LY294002作用A549/GR细胞，p-AKT、ABCG2均下调（P<0.05）。IGF-1作用A549细胞后，较未加入激活剂的A549细胞，其外排作用增强（P<0.05）。LY294002作用A549/GR细胞后，较未加入激活剂的A549/GR细胞，其外排作用减少（P<0.05）。提示PI3K/AKT激活剂和抑制剂可以调节Rh123的外排，故PI3K/AKT通路可能调节ABCG2的表达，与既往研究一致。

有报道[21-22]提示肺癌干细胞中ABCG2高表达，并与肺癌的耐药相关。另外一项研究结果提示[23]，手术前后NSCLC患者的ABCG2的表达，可见未手术的NSCLC患者血清中ABCG2的表达高于健康人及术后患者。本研究结果提示，健康人的ABCG2表达明显低于NSCLC非耐药组患者（P<0.05），NSCLC吉非替尼耐药组患者的ABCG2表达均高于NSCLC非耐药组患者及健康人（P<0.05）。证实ABCG2在NSCLC中要高于健康人群，吉非替尼耐药的NSCLC的表达高于NSCLC的人群。由此研究可见，ABCG2可作为吉非替尼耐药NSCLC的重要標记，对于预测耐药及指导后续耐药后治疗至关重要。

综上所述，ABCG2在NSCLC吉非替尼耐药中起到了重要的作用，本实验验证了ABCG2可作为预测EGFR-TKI耐药的重要指标，并证明了逆转ABCG2介导的NSCLC 靶向耐药主要通过调节PI3K/AKT信号通路，后在NSCLC的患者中验证了这一推测，但本研究仍然具有一定的局限性，并没有行亚组及ABCG2与非小细胞肺癌患者治疗疗效及生存期的分析，值得进一步的探讨，为吉非替尼耐药的NSCLC治疗提供依据。

[参考文献]

[1]Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

[2]Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2016[J].CA Cancer J Clin，2016，66（1）：7-30.

[3]钟锐，邬麟，江美林，等.EGFR-TKIs获得性耐药的机制及其治疗的研究进展[J].肿瘤药学，2017，7（6）：641-647.

[4]刘红柳，杨家梅.培美曲塞联合吉非替尼治疗EGFR-TKI耐药后晚期非小细胞肺癌临床观察[J].中国癌症杂志，2017， 27（2）：135-139.

[5]Guo J，Jin D，Wu Y，et al.The miR 495-UBE2C-ABCG2/ERCC1 axis reverses cisplatin resistance by downregulating drug resistance genes in cisplatin-resistant non-small cell lung cancer cells[J].Ebio Med，2018，35（9）：204-221.

[6]Zhang GN，Zhang YK，Wang YJ，et al.Epidermal growth factor receptor （EGFR） inhibitor PD153035 reverses ABCG2-mediated multidrug resistance in non-small cell lung cancer：In vitro and in vivo[J].Cancer Lett，2018，28（6）：19-29.

[7]张靖，马虎，陈正堂，等.ABCG2在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药中的作用[J].第三军医大学学报，2014，36（10）：987-991.

[8]Tang L，Zhang C，He H，et al.Associations between ABCG2 gene polymorphisms and gefitinib toxicity in non-small cell lung cancer：a meta-analysis[J].Onco Targets Ther，2018，11（1）：665-675.

[9]Biedler JL，Riehm H.Cellular resistance to actinomycin D in Chinese hamster cells in vitro：cross-resistance，radioautographic，and cytogenetic studies[J].Cancer Res，1970，30（4）：1174-1184.

[10]Wu Q，Yang Z，Nie Y，et al.Muti-drug resistance in cancer chemotherapeutics：mechanisms and lab approaches[J].Cancer Lett，2014，347（2）：159-166.

[11]Xie T，Mo L，Li L，et al.Identification of side population cells in human lung adenocarcinoma A549 cell line and elucidation of the underlying roles in lung cancer[J].Oncol Lett，2018，15（4）：4900-4906.

[12]严晓丽，杜梦楠，郑纪宁.ABC转运蛋白相关microRNA 与肿瘤多药耐药的研究进展[J].广东医学，2017，38（23）：3685-3688.

[13]王诗琦，刘克辛.外排型转运体与肿瘤多药耐药[J].药物评价研究，2018，41（6）：952-957.

[14]Hegedus C，Truta-Feles K，Antalffy G，et al.Interaction of the EGFR inhibitors gefitinib，vandetanib，pelitinib and neratinib with the ABCG2 multidrug transporter：implications for the emergence and reversal of cancer drug resistance[J].Biochem Pharmacol，2012，84（3）：260-267.

[15]Maricla G，Giorgio PP，Claudia F，et al.Effect of ABCG2/BCRP expression on efflux and uptake of gefitinib in NSCLC cell lines[J].PLoS One，2015，10（11）：e0141795.

[16]Ho MM，Ng AV，Lam S，et al.Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells[J].Cancer Res，2007，67（10）：4827-4833.

[17]Chen YJ，Huang WC，Huang MC，et al.Elecated BCRP/ABCG2 expression confers acquired resistance to gefitinib in wild-type EGFR-expressing cells[J].PLoS One，2011，6（6）：214-228.

[18]李静，朱冰.PI3K/AKT信号通路与EGFR-TKIs治療NSCLC耐药的相关性研究进展[J].重庆医学，2018，47（17）：2340-2343.

[19]胡丽娜，彭兴春，郭显智，等.抑制Notch和PI3K/Akt信号通路对食管腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响[J].肿瘤防治研究，2016，43（8）：653-658.

[20]杨金成，陈福宝，周丽娟.LY294002对人肾透明细胞腺癌细PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响[J].宁夏医学杂志，2018，40（10）：896-898.

[21]Hu J，Li J，Yue X，et al.Expression of the cancer stem cell markers ABCG2 and OCT-4 in right-sided colon cancer predicts recurrence and poor outcomes[J].Oncotarget，2017， 8（17）：28 463-28 470.

[22]赖红锦，林锋，陈楠，等.肺癌干细胞作为靶点的肺癌治疗策略研究进展[J].中国肺癌杂志，2018，21（1）：57-62.

[23]王大星，谢彤.手术前后非小细胞肺癌血清ABCG2水平的影响[J].中国癌症防治杂志，2011，3（1）：56-58.

（收稿日期：2018-11-20  本文编辑：孟庆卿）