针刺足三里对苯妥英钠在小鼠血浆及大脑皮质药物浓度的影响

杨晓婷 ，林 燊 ，叶丽宏 ，金 钦 ，齐诗仪 ，林 栋 （.福建中医药大学针灸学院，福建 福州350；.福建中医药大学药学院，福建 福州350）

苯妥英钠是被广泛用于癫痫发作的传统抗癫痫药物，临床证明针药联用可以产生更佳疗效［1］。随着药动学以及针刺机理研究深入，提示针药联用可能通过影响药物在体内的吸收、分布和代谢等过程，改变了血药浓度、靶器官药物浓度进而产生协同作用［2］。故本实验旨在探究针刺效应对小鼠血浆及大脑皮质中苯妥英钠浓度改变的影响途径。

1 实验材料

1.1 实验动物 18只ICR小鼠均由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，在福建中医药大学动物实验研究中心SPF级动物室中进行饲养，温度（25±2）℃，相对湿度40%～60%，自由饮水进食。

1.2 仪器与试药 超高效液相色谱仪（型号：ACQUITY UPLC I-Class，美国 Waters公司）；三重四极杆质谱（型号：Xevo TQ-S，美国 Waters公司）；十万分之一分析天平（型号：CPA225D，德国Sartorius公司）；乙腈（德国Merck公司）、甲醇（德国Merck公司）均为色谱纯；Mili-Q超纯水（美国Milipore公司）；甲酸（上海阿拉丁试剂有限公司）为色谱纯；苯妥英钠（中国食品药品检定研究院，纯度99.0%，批号：100210-201303）；延胡索乙素（中国食品药品检定研究院，纯度 99.0%，批号：110726-201718）。

2 实验方法

2.1 实验动物分组与干预 18只ICR小鼠根据随机数字表法分为针药30 min组、药针30 min组、药物30 min组、针药60 min组、药针60 min组和药物60 min组，每组各3只。各组干预措施：针药30 min组及60 min组，针刺足三里后腹腔注射苯妥英钠，注射后30 min组及60 min组取材；药针30 min组及60 min组，腹腔注射苯妥英钠后针刺足三里，针刺后10 min及40 min取材；药物30 min及60 min组，腹腔注射苯妥英钠，注射后30 min及60 min取材。取穴：足三里选穴参照李忠仁主编的《实验针灸学》，足三里位于小鼠膝关节后外侧，在腓骨小头下约0.5 cm处；针刺方式：采用0.25×13 mm一次性无菌针灸针（北京中研太和医疗器械有限公司，批号：171258）针刺双侧足三里，进针深度约1.5 mm，每5 min行一次平补平泻捻转手法；给药方式：腹腔注射苯妥英钠0.5 mL／g。

2.2 样品采集 所有动物处理均按照2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》［3］的规定。血浆样品采集：干预结束后，按压小鼠眼周使眼球充血突出，用镊子快速摘取小鼠眼球，并使血液从眼眶内流入EP管中约1 mL，震荡离心分离血清，-20℃冰箱中保存。大脑皮质样品采集：干预结束后，取出全脑，将全脑沿矢状面切开，钝性分离大脑皮质，称重后放入EP管，液氮中速冻，-20℃冰箱中保存。

2.3 对照品溶液制备 精密称取苯妥英钠对照品9.95 mg至10 mL量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，备用（母液浓度为 0.995 mg／mL）。 精密吸取苯妥英钠母液1 mL至50 mL量瓶中，加入甲醇稀释并定容，摇匀，为苯妥英钠储备液（浓度为19.9μg／mL）。精密称取内标物延胡索乙素对照品8.40 mg至20 mL量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，备用（母液浓度为0.42 mg／mL）。精密吸取延胡索乙素母液100μL至100 mL量瓶中，加入甲醇稀释并定容，摇匀，为延胡索乙素储备液（浓度为 420 ng／mL）。

2.4 供试品溶液制备 精密吸取融化至室温的血浆样品50μL，加入到5 mL的EP管中，先加入20 μL延胡索乙素储备液，后加入乙腈至2 mL，涡旋1 min；取1 mL上述溶液，以14 000 r／min离心15 min除去蛋白；取上清液100μL，加入乙腈稀释10倍，混匀，以 14 000 r／min离心 15 min，吸取上清液100μL于进样瓶，进行液相质谱测定。大脑皮质样品融化至室温后，按 2 倍质量体积比（mg∶μL＝1∶2）加入0.9%生理盐水，进行匀浆，涡旋混匀，制成0.5 g／mL的组织匀浆液；取100μL组织匀浆液，加入20μL的延胡索乙素储备液，加入乙腈至2 mL，涡旋 1 min；取 1 mL上述溶液，以 14 000 r／min离心15 min除去蛋白；取上清液100μL，加入乙腈稀释10倍，混匀，以 14 000 r／min离心 15 min，吸取上清液100μL于进样瓶，进行液相质谱测定。

2.5 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC@BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脱（0.0～2.0 min，25%A→70%A；2.0～3.0 min，70%A→70%A；3.0～3.1 min，70%A→25%A；3.1～5.0 min，25%A→25%A）；进样量：2 μL；流速：0.25 mL／min；柱温：45 ℃。

2.6 质谱条件 离子源：电喷雾离子源；质谱检测器：三重四级杆质谱检测器；检测模式：正离子（ESI+）模式下的多反应监测（MRM）定量模式。毛细管电压 3 500 V；脱溶剂气流（氮气）流速 800 L／h；脱溶剂温度500℃；离子源温度150℃；锥孔气流（氮气）流速 50 L／h；碰撞气体（氩气）流速为 0.13 mL／min；苯妥英钠保留时间：2.53 min；定量离子对：253.1→182；锥孔电压：40V；碰撞能量：18V。延胡索乙素保留时间：1.79 min；定量离子对：356→192；锥孔电压：40V；碰撞能量：28V。

2.7 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（x±s）表示，采用单因素方差分析。

3 结 果

3.1 标准曲线的绘制 以对照品浓度（X）为横坐标，对照品与内标峰面积之比（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到：

血浆标准曲线：

Y＝0.368 6 X＋0.238 9（r＝0.998 5）

大脑皮质标准曲线：

Y＝0.423 8 X－0.090 0（r＝0.998 6）

3.2 样品测定按照“2.4”项下方法制备样品溶液，按“2.5”和“2.6”项下色谱与质谱条件测定信号强度，根据标准曲线计算各分析物的含量。结果见图1。

图1 血浆和大脑HPLC色谱图

3.3 各组苯妥英钠药物浓度比较 见图2。

图2 各组苯妥英钠药物浓度比较

4 讨 论

苯妥英钠是传统的抗癫痫乙内酰脲类药物之一，主要用于治疗全身强直性痉挛性发作和部分性发作［4-6］等症。苯妥英钠血药浓度与不良反应呈正相关且半衰期延长，同时治疗窗狭窄，安全范围小［7-9］，故苯妥英钠容易发生蓄积和急性中毒并产生各种严重的不良反应。彭俊平［10］用苯妥英钠和丙戊酸钠治疗癫痫效果相近，但苯妥英钠的不良反应总发生率较高。苯妥英钠因疗效及经济原因尚应用于临床，在临床中仍有独特优势［11］。针药联用可提高疗效、缩短疗程、减轻药物毒副作用，作为一种重要的治疗手段在临床上得到推广［12］。

本实验探讨针刺足三里对于苯妥英钠在小鼠血浆及大脑皮质药物浓度的影响。在相同给药时长30 min基础上，增加针刺干预后苯妥英钠血药浓度明显低于药物30 min组。至苯妥英钠给药时长60 min时，针刺组与药物60 min组比较虽无显著差异，但苯妥英钠血药浓度仍有偏低的趋势；血药浓度呈下降趋势同时，各组大脑皮质药物浓度比较虽无显著性差异，但针刺干预组别呈增加趋势；针刺干预30 min组别血药浓度显著性降低的同时，大脑皮质的浓度有提高的趋势。出现这一现象的可能原因是：针刺足三里促进药物分子通过血脑屏障，表现为大脑皮质药物浓度的升高，但具体原因有待进一步扩大样本量加以证实。苯妥英钠在人体内吸收呈双峰值状态，针刺足三里对于苯妥英钠药物浓度的影响方式仍需增加更多监测时段证实。苯妥英钠半衰期为7～22 h，经肝代谢为“对羟基苯妥英钠”，无生物活性，由肾脏排出。由于苯妥英钠代谢饱和，当血药浓度逐渐增加时，半衰期逐渐延长，易发生不良反应。本实验表明针刺足三里可降低苯妥英钠血药浓度，但大脑皮质浓度无明显下降，其机制可能是加快靶向性药物的体内代谢过程，但具体代谢途径需进一步验证。