白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP3的生物信息学分析

相伟芳，杨艺新，郭美琪，张新玥，李 敏，潘丽娜

（1.天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）

美国白蛾Hyphantriacunea（Drury）又名美国灯蛾，属鳞翅目（Lepidoptera）灯蛾科（Arctiidae）[1]，具有食性杂、繁殖量大及适应性强等特点，是一种对林业和农业造成严重危害的世界性检疫害虫[2].1979年，美国白蛾首次在我国被发现，随后扩散到我国的其他地区并造成严重危害[3-4].为了减轻美国白蛾的危害，杨忠岐[5]连续多年对该害虫的天敌进行调查，最终在陕西地区发现了一种新的美国白蛾寄生蜂—白蛾周氏啮小蜂（Chouioia cuneaYang）.白蛾周氏啮小蜂属姬小蜂科（EuloPhidae）啮小蜂属（Tetrastichus），是美国白蛾蛹期的重要寄生性天敌[6]，在控制美国白蛾的数量方面起着重要作用.目前，白蛾周氏啮小蜂已经被广泛应用于美国白蛾的防治中并取得显著成效[7].白蛾周氏啮小蜂主要通过嗅觉系统定位寄主.昆虫的嗅觉系统主要包括气味结合蛋白（Odorant binding proteins，OBPs）、化学感受蛋白（Chemosensory proteins，CSPs）、神经元膜蛋白（Sensoryneuronmembraneproteins，SNMPs）及气味受体（Olfactory receptors,ORs）蛋白等[8].气味分子进入感器淋巴液中，与淋巴液中的气味结合蛋白结合，激活嗅觉神经元膜上的气味受体，产生动作电位，从而引起一系列的行为反应[9].气味结合蛋白可以与气味分子特异结合，对气味分子起到初步的过滤作用，是昆虫嗅觉识别过程中关键的一步.因此，OBPs与气味分子的结合是本领域的研究热点.关于白蛾周氏啮小蜂对美国白蛾气味识别的研究已有一些报道.如Zhao等[10]首次对雌雄白蛾周氏啮小蜂的触角进行了测序，共测定出25个气味结合蛋白、80个气味受体、10个离子受体（Ionotropic receptors，IRs）、11个化学感受蛋白、1个神经元膜蛋白和17个味觉受体（Gustatory receptors，GRs）.Zhu等[11]对美国白蛾蛹、老熟幼虫和虫粪的挥发物进行了检测，共测定出了18种化合物.赵燕妮等[12]和张新玥等[13]在此基础上分别对气味结合受体CcOR83b和CcOR1进行了分子进化分析.王凤竹等[14]对气味结合蛋白CcOBP1进行了进化分析.

分子对接技术是近年来被应用于昆虫嗅觉研究的生物分析技术，它通过构建蛋白质与小分子化合物的三维结构，将小分子匹配到蛋白质的结合位点上，通过计算结合力来筛选与蛋白结合的小分子物质[15].如Li等[16]利用分子对接技术研究了中华蜜蜂（Apis cerana）的化学感受蛋白CSP1；Du等[17]利用该技术探究了含杂环的（E）-β-法尼烯类似物与蚜虫气味结合蛋白的结合模式.

目前，对于白蛾周氏啮小蜂嗅感蛋白的研究较少.本研究选取白蛾周氏啮小蜂雌雄触角均大量表达的一个气味结合蛋白CcOBP3，通过软件预测及分子对接技术，对CcOBP3进行多角度分析，为探明CcOBP3的结合特性提供理论基础，也为后续的白蛾周氏啮小蜂嗅觉机制的研究积累数据.

1 材料与方法

1.1 Cc OBP3序列分析

1.1.1 材料

CcOBP3碱基序列由本课题组前期通过转录组测序技术对雌雄白蛾周氏啮小蜂的触角进行测序获得[10].选取美国白蛾蛹、老熟幼虫和虫粪的挥发物以及常见的植物挥发物共8种小分子物质用于CcOBP3的分子对接.美国白蛾的挥发物[11]包括：邻苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，C10H10O4）、正戊醛（Valeraldehyde，C5H10O）、十六烷（n-Hexadecane，C16H34）、正十五烷（n-Pentadecane，C15H32）、正十四烷（Etradecane，C14H30）.植物挥发物[18-20]包括：苊（Acenaphthene，C12H10）、3-蒈烯（3-Carene，C10H16）和丁酸丁酯（n-Butylbutyrate，C8H16O2）.

1.1.2 方法

应用Bio Edit分析CcOBP3序列的氨基酸残基数及相对分子质量；EXPASY平台中的SignalP3.0 Serve（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）用于预测信号肽 及其 所在位 置；HMMTop（http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html）用于预测蛋白的跨膜结构域.

1.2 分子对接

1.2.1CcOBP3同源建模及模型评价

将CcOBP3的氨基酸序列作为建模模板，在Swiss-Model（http://swissmodel.expasy.org/）上对CcOBP3进行同源建模[21]，获得蛋白的三维结构.用Ramachandran图评价CcOBP3蛋白三维结构的质量[22].

1.2.2CcOBP3分子对接

美国白蛾挥发物以及常见的植物挥发物共8种小分子物质用于CcOBP3的分子对接.从Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载8种小分子的三维结构[23]，准备进行分子对接.首先用Schrodinger Suites 2015-2中的maestro10.2软件将CcOBP3的三维结构导入，手动输入蛋白三维结构具体坐标并进行调整，尽可能使蛋白的活性中心位于盒子的中心，生成文件保存.然后导入8种小分子物质的结构，搜索小分子物质的其他构象，生成文件保存.最后用maestro10.2进行分子对接，Pymol v1.3显示对接结果.

2 结果与分析

2.1 CcOBP3序列分析结果

CcOBP3的开放阅读框为453 bp，编码150个氨基酸，相对分子质量为16 747.90.软件预测该蛋白有信号肽，位于第28~29位氨基酸残基之间，如图1所示.CcOBP3含有一个跨膜结构域，位于第7~23位氨基酸残基上.

图1 Cc OBP3的信号肽位置预测结果Fig.1 Prediction results of Cc OBP 3 signal peptide position

2.2 CcOBP3分子对接结果

2.2.1CcOBP3同源建模结果

利用Swiss-Model在线搜索白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP3最佳模型的模板.结果表明，意大利蜜蜂（Apis mellifera）的气味结合蛋白OBP5（ID:3r72.1）与白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP3的相似度最高，为36.75%.一般来说，模型的相似度在30%以上便可获得相对合理的构象[24].因此，意大利蜜蜂的气味结合蛋白OBP5可作为白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP3的模板，通过Swiss-Model构建白蛾周氏啮小蜂CcOBP3的结构模型.

白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP3的三维结构有6个α螺旋，分别为Arg32-Thr51（α1）、Leu54-Asn63（α2）、Pro69-Leu81（α3）、Ala93-Ile102（α4）、Ile108-Val116（α5）、Pro128-Glu142（α6），如图2所示.

图2 白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白Cc OBP3的3维结构Fig.2 3D structure of odorant binding protein Cc OBP3 of Chouioia cunea

CcOBP3拉式构象的分析结果如图3所示.由图3可以看出，97.5%的CcOBP3氨基酸残基落在最佳区域（蓝色区域），1.7%的氨基酸残基落在较合理区域（紫色区域），只有0.8%的氨基酸残基落在不允许区域（白色）.有97.5%的CcOBP3氨基酸残基落在最佳区域，大于90%，说明该蛋白模型较为合理.

图3 Cc OBP3 3维模型的拉氏构象评价Fig.3 Rational evaluation of the established 3D model of Cc OBP3 by Ramachandran plot

利用PROSA（https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php）对同源建模所得蛋白质结构模型进行能量评价，评价结果如图4所示.由图4可以看出，Z-score值为-5.82，一般Z-score为负值就表示此蛋白的结构模型是合理的.经2种方法对CcOBP3模型进行评价，确认CcOBP3经同源建模获得的模型构象合理，可以用于后续的分子对接.

图4 Cc OBP3蛋白整体模型质量Fig.4 Overall quality of Cc OBP3 model

2.2.2CcOBP3与小分子物质的对接结果

用maestro10.2软件计算CcOBP3与8种小分子物质的结合能量.对接完成后，得到各个化合物与CcOBP3结合的结合常数，如表1所示.结合常数的绝对值越大，说明CcOBP3与该化合物结合所需的自由能越少.根据分子对接结果，3-蒈烯与CcOBP3的结合特性最大，美国白蛾的挥发物成分邻苯二甲酸二甲酯和正戊醛也与CcOBP3有较强的结合特性.

表1 可能与Cc OBP3结合的化合物及结合常数Tab.1 Compounds and binding constants that may bind Cc OBP3

CcOBP3与3-蒈烯主要通过范德华力等进行结合，具体结合过程如图5所示.CcOBP3的Met-96、Val-139、Phe-148和Phe149与3-蒈烯通过碳磷键结合；Pro-150、Phe-135、Met-79和Ile-100与3-蒈烯通过碳碳键结合；Met-82、Thr-84、Gln-99、Met-103、Val-104和Thr136通过范德华力结合.

图5 Cc OBP3与小分子化合物对接结果Fig.5 Docking results of Cc OBP3 with small molecule compound

3 讨论与结论

CcOBP3是在白蛾周氏啮小蜂触角中大量表达的一个气味结合蛋白.本课题组前期通过转录组测序技术获得了CcOBP3的cDNA全序列，用Bio Edit、EXPASY平台中的SignalP3.0 Serve和HMMTop软件分析了CcOBP3的碱基序列，结果表明，CcOBP3具有昆虫气味结合蛋白的典型特征，即相对分子质量小、有6个保守的半胱氨酸位点，在N端有信号肽.

分子对接技术是基于计算机模拟技术，通过构建蛋白和小分子化合物的三维构象，将小分子匹配到蛋白质的结合位点上进而评估结合力强弱的一种生物分析技术.利用分子对接技术，针对白蛾周氏啮小蜂的CcOBP3在美国白蛾蛹等的挥发物中筛选能够与之结合的物质，最终得到与CcOBP3特异结合的化合物，明确CcOBP3的结合特性.利用Swiss-Model在线搜索建模，结果表明，意大利蜜蜂的气味结合蛋白OBP5（ID:3r72.1）与白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP3的相似度最高.Rama-chandran和PROSA能量评价结果均表明模型构象合理.分子对接的结果表明，白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP3可能与3-蒈烯结合.3-蒈烯是精油中单萜烯的主要组分，具有强烈的松木样香.据报道，3-蒈烯对一些昆虫具有吸引作用.例如，3-蒈烯对红脂大小蠹具有一定的吸引作用[25]；3-蒈烯对花绒寄甲也有明显的引诱作用[26].因此推测CcOBP3的功能与引诱作用相关.

本研究通过软件分析和分子对接技术对白蛾周氏啮小蜂气味结合蛋白CcOBP3进行了多角度的预测分析，为CcOBP3的后续研究和进一步探明白蛾周氏啮小蜂的嗅觉机制积累数据.