可切换亲水溶剂高效提取藻油及岩藻黄素含量分析

孙维维，林 欣，史博文，温运启，李兆杰，姜晓明，黄文灿，薛长湖

(中国海洋大学 食品学院，山东 青岛 266003)

岩藻黄素是一种主要的海洋类胡萝卜素，在一些大型和微型藻类中大量存在，占自然界类胡萝卜素估计总产量的10%以上。在微藻中寻找天然岩藻黄素来源时发现，三角褐指藻含有的岩藻黄素为主要类胡萝卜素[1]。岩藻黄素及其代谢产物已被证明具有多种益处[2]，包括抗氧化、抗炎、抗癌和抗肥胖效果[3-4]。Maeda等[5]证明，在小鼠和大鼠的饮食中添加岩藻黄素导致其腹部白色脂肪组织减少。因此，岩藻黄素值得进一步研究。

目前从微藻中提藻油的方法主要使用有机溶剂提取，经过旋转蒸发得到藻油[6-7]，如果要投入工厂化生产，旋转蒸发耗能巨大。本文采用可切换溶剂，用CO2和水，节能高效地提取藻油。可切换溶剂是可以转换亲水亲油特性的一种特殊液体，在通入或者去除CO2的情况下可逆地从一种形式切换到另一种形式[8]，包括可转换亲水性溶剂(SHS)和可转换极性溶剂(SPS)[9]，其不挥发且不易燃，从而避免溶剂回收过程中的挥发或蒸馏。作为提取溶剂，SHS比SPS以及常规提取溶剂更具吸引力，因为SHS更适合提取含水量较多的物料。如果SPS提取含水量较高的物料则会形成一种碳酸氢盐[10]。除此之外，SHS价格更低，更稳定。SHS与水的混溶性是完全可逆的，因为在轻轻地除去(即用低热量，用惰性气体鼓泡)之后，SHS会返回到原来的疏水状态。Huang等[11]提出用可切换溶剂N，N-二甲基环己胺(DMCHA)从雨生红球藻中提取虾青素。

本文探讨可切换亲水溶剂DMCHA提取三角褐指藻藻油的可行性，探究三角褐指藻干粉以及80%水分含量的三角褐指藻藻泥的藻油得率随着时间以及料液比的变化，用扫描电镜观察三角褐指藻干粉提油前后的表面结构变化，并分析比较了氯仿甲醇法、乙醇法、DMCHA法提取的藻油岩藻黄素含量，最后通过分析藻油中溶剂残留判断分离效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

三角褐指藻藻泥，青岛能源所提供。藻泥储存在-20℃，藻泥冻干后得到的干粉储存在干燥器皿内。

乙腈(色谱纯)，德国Merck公司；甲基叔丁基醚(色谱纯)，美国Muskegon公司；盐酸、N,N-二甲基环己胺(DMCHA)、对苯二甲酸二甲酯、二氯甲烷、氯仿、无水乙醇、D-14己烷，均为分析纯。

磁力搅拌器；循环水式真空泵；TGL-20K离心机；1100型HPLC仪(配有二极管阵列检测器),美国Agilent公司；Lab-1A-50E冷冻干燥机；UV-2550紫外分光光度计，日本岛津公司；Hitachi S-4800扫描电子显微镜，日本Hitachi；MMV-1000W型振摇器；核磁日本精密电子天平；RE52CS型旋转蒸发仪；布鲁克600 MHz核磁共振谱仪。

1.2 实验方法

1.2.1 三角褐指藻藻油提取

分别称量三角褐指藻藻泥和干粉1 g加入一定量的DMCHA。将微藻-DMCHA混合物在室温下磁力搅拌一段时间。然后，以7 000 r/min离心5 min。上清液加入相当于DMCHA两倍体积的H2O，并使用气体分散管对混合物进行CO2鼓泡15 min。在藻油层漂浮到溶液顶部之后，收集藻油入玻璃瓶中，放入-20℃的冰箱中储存。

1.2.2 岩藻黄素含量测定

1.2.2.1 提取

氯仿甲醇法：取三角褐指藻干粉1 g，加入20 mL 氯仿甲醇(体积比2∶1)混合溶剂，室温磁力搅拌器提取1 h后抽滤，滤液加入与甲醇等体积的水，静置分层后取氯仿层旋蒸得到藻油，溶于乙腈中并用0.22 μm的滤膜过滤于液相小瓶中待检测。

乙醇法：取三角褐指藻干粉1 g，加入20 mL无水乙醇，室温磁力搅拌器提取3 h后抽滤，滤液旋蒸得到藻油，溶于乙腈中并用0.22 μm的滤膜过滤于液相小瓶中待检测。

DMCHA法：取三角褐指藻干粉1 g，加入20 mL DMCHA，室温磁力搅拌器提取3 h后加水通CO2后得到藻油，溶于乙腈中并用0.22 μm的滤膜过滤于液相小瓶中待检测。

1.2.2.2 液相色谱分析

使用装备有紫外检测器(日本京都岛津的SPD-20A)和Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)的HPLC测定岩藻黄素含量。流动相为80%的乙腈(A)和20%甲基叔丁基醚(B)；流速0.8 mL/min；洗脱程序为0～8 min 100%A，8～16 min 90%A，16～22 min 100%A；柱温25℃；进样量30 μL；检测波长450 nm。

1.2.3 藻粉提油前后表面结构变化

使用扫描电子显微镜在20 kV的加速电压下表征三角褐指藻干粉提油前后的形态[12]。

1.2.4 藻油中DMCHA残留量分析

2 结果与讨论

2.1 三角褐指藻干粉的藻油得率

选择三角褐指藻干粉为原料，在室温下，测定三角褐指藻干粉在不同料液比、不同提取时间条件下的藻油得率。结果见图1。

由图1可知，随着料液比由1∶5增加到1∶25，藻油得率不断上升，增长趋势逐渐降低，到1∶15之后藻油得率缓慢增长，到1∶20之后几乎无增长。根据传质平衡的原理，在一定范围内，提取溶剂越多，溶解于其中的油越多，得率越高[14]。随着提取时间延长，藻油得率也逐渐增加，到12 h以后趋于稳定。随着提取时间的延长，藻粉与提取溶剂中的油浓度差不断缩小，一定时间后，二者中的油浓度基本相同，此时扩散基本达到平衡[15]。最终干粉藻油得率在料液比1∶25、提取时间24 h条件下达到21.29%。

图1 三角褐指藻干粉藻油得率随料液比、提取时间的变化

2.2 三角褐指藻藻泥的藻油得率

选择三角褐指藻藻泥为原料，在室温下，测定三角褐指藻藻泥在不同料液比、不同提取时间条件下的藻油得率。结果见图2。

图2 三角褐指藻藻泥藻油得率随料液比、

由图2可知，三角褐指藻藻泥的藻油得率明显比干粉藻油得率低，随着料液比由1∶5增加到1∶25，藻油得率先快速上升，到1∶20之后藻油得率趋于稳定。随着提取时间延长，藻油得率也逐渐增加，到12 h后趋于稳定，与三角褐指藻干粉提取藻油的趋势一致。最终三角褐指藻藻泥的藻油得率在料液比1∶25、提取时间24 h条件下达到13.29%。

2.3 藻油中岩藻黄素含量

2.3.1 岩藻黄素的全波长扫描(见图3)

由图3可知，三角褐指藻DMCHA提取液显示出岩藻黄素的特征吸收峰，最大的吸收峰在449 nm，可以确定提取液中主要成分为岩藻黄素。此外，在667 nm波长处有一个小的吸收峰，查阅文献[16-17]可知，此处为叶绿素的特征峰，说明提取液中含有一定量的叶绿素。

图3 岩藻黄素提取液全波长扫描

2.3.2 不同提取方法的岩藻黄素含量比较(见表1)

表1 氯仿甲醇法、DMCHA法、乙醇法提取藻油岩藻黄素含量比较 mg/g

由表1可以看出，DMCHA法提取的藻油岩藻黄素总含量为9.17 mg/g，与氯仿甲醇法总含量相差不大，证明其能较好地提取出岩藻黄素。相同提取条件下乙醇法提取的岩藻黄素总含量最高，与之前的研究相符[1]。可能是岩藻黄素溶出速率比较高，且乙醇对岩藻黄素的溶解度高。与氯仿甲醇法和乙醇法相比，DMCHA法提取的岩藻黄素异构体I含量最低，值得进一步探究其原因及改进措施来提高DMCHA对岩藻黄素的提取率。

2.4 提油前后三角褐指藻干粉的表面结构变化(见图4)

A

B

由图4A可知，提油前，三角褐指藻干粉具有规则的表面并且被油性物质覆盖而没有明显的破坏。提油后(图4B)，三角褐指藻干粉更加分散，且表面出现许多空隙，证明DMCHA破坏了三角褐指藻整体结构的完整性，从而增加了藻油的溶出。

2.5 DMCHA在藻油中的残留(见图5)

由图5可知，在藻油层中存在19.861 mg DMCHA，相当于DMCHA添加量(10 mL)的0.231%。证明所提取的藻油溶剂残留很低，分离效果很好。另外水层胺恢复成油溶性DMCHA之后经测定，溶剂回收率为93.2%，可以循环使用。

注：A为对苯二甲酸二甲酯的苯环上的氢峰，B为对苯二甲酸二甲酯的特征性甲基氢峰，C为DMCHA的特征性甲基氢峰，D为溶剂(D-14己烷)特征峰。

图5 藻油中DMCHA残留核磁图

3 结 论

本文用可切换亲水溶剂DMCHA从三角褐指藻干粉以及藻泥中提取藻油，与氯仿甲醇法提取的藻油中岩藻黄素总含量相差不大，低于乙醇法提取的藻油中岩藻黄素总含量。在室温下，料液比1∶25提取24 h，三角褐指藻干粉藻油得率为21.29%，藻泥藻油得率为13.29%。因此，用干粉作为藻油的提取原料时提取效率更高。DMCHA溶剂的回收率为93.2%，藻油中DMCHA残留量为DMCHA添加量的0.231%。