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pH对水酶法大豆乳状液稳定性影响的机理研究

2019-04-29齐宝坤谢凤英

中国油脂 2019年3期
关键词:乳状液水性电位

胡 淼,齐宝坤,谢凤英,2,李 杨

(1.东北农业大学食品学院,哈尔滨 150030; 2.哈尔滨市食品产业研究院,哈尔滨 150028)

我国现行提取植物油脂的方法主要有压榨法和溶剂浸提法,但压榨法存在油脂提取率低的问题,溶剂浸提法存在溶剂残留问题。水酶法是一种经济、绿色、安全无污染的油脂提取技术[1],同时产生的副产物——蛋白和膳食纤维具有较高的功能特性[2],但在利用水酶法提取油脂的过程中,油脂进入水相,油料蛋白作为表面活性剂吸附在油脂表面形成稳定的乳状液[3],使得大量的油脂存在于乳状液中,降低了油脂的提取率,因此研究乳状液的稳定性对于乳状液的破除,提高油脂提取率至关重要。

大量研究表明乳状液的稳定性主要受有机溶剂、酶、温度、盐离子强度、pH等影响:迟延娜等[4]研究了水酶法提取油脂过程中由温度和pH协同作用形成的顽固乳状液的破除,发现50%的乙醇能够明显降低乳状液稳定性,使游离油的得率达到90%;Li等[5]研究了酶解对生物解离花生乳状液稳定性的影响,发现随着酶解时间逐渐延长,乳状液的界面张力增加,稳定性逐渐降低;崔健等[6]比较了不同的环境因素(温度、盐离子强度、pH)对乳清蛋白乳状液稳定性的影响,结果表明pH是影响乳清蛋白乳状液稳定性的主要因素; Chabrand等[7]采用调节pH的方法进行破乳,破乳率可达83%。大量的研究表明pH对于乳状液的稳定性有显著的影响,但是鲜少有人进行pH对乳状液结构及稳定性机理的研究。因此,在前期对大豆乳状液组成和相关性质研究的基础上[8],本文主要研究不同pH下乳状液的性质及其中蛋白质结构的变化,阐明pH影响乳状液稳定性的机理,为生物解离技术破除乳状液提供理论基础,推进生物解离技术的产业化应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

大豆,东农-42;Protex 6L 碱性蛋白酶,杰能科生物工程有限公司;十二烷基硫酸钠(SDS)、β-巯基乙醇,美国Sigma公司;考马斯亮蓝G-250,南京生兴生物技术有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪器与设备

FW100型高速万能粉碎机,绍兴科宏仪器有限公司;挤压膨化机,东北农业大学自制;ZNCL-BS电动磁力搅拌器;激光共聚焦显微镜;LGJ-1冷冻干燥机;GL-21M高速冷冻离心机;Mini-PROTEAN Tetra电泳仪,美国Bio-Rad Laboratories公司;TNZ1-5700傅里叶红外光谱仪,英国Thermo Fisher公司;F2000荧光光谱仪,日本日立(Hitachi)公司;Mastersizer 2000粒度仪、Nano-ZS90Zeta电位仪,英国马尔文仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解及乳状液分离

脱皮大豆进行挤压膨化预处理,按照1∶6的质量比与蒸馏水混合均匀后,在60℃恒温水浴锅中加热,2 mol/L NaOH调节pH保持在9.0左右,加入一定量的Protex 6L 碱性蛋白酶,酶解3 h,90℃下灭酶90 s,在4 500 r/min下离心20 min,离心后吸取游离油,将其余液体部分倒入分液漏斗,静置24 h分层后,将乳状液分离。

1.2.2 乳状液的pH处理

酶解大豆获得的乳状液pH为8.25(空白)。称取20 g原始乳状液,分别用1 mol/L的HCl和NaOH调节原始乳状液的pH至2、4、5、6、8、10,静置1 h,然后在3 585g下离心10 min,分离乳状液和水相。

1.2.3 乳状液粒径及电位的测定

采用Mastersizer 2000粒度仪测定乳状液体积加权平均值(D4,3)。将乳状液稀释1 000倍,保持粒径数值在测定范围内,设定大豆油滴的折射指数(RI)为1.47,分散剂的RI为1.333,吸光值为0.001,在室温下进行测定。

采用Zeta电位仪测定乳状液的Zeta电位。将乳状液稀释1 000倍后进行测定,上样体积为1 mL,测定温度为25℃。

1.2.4 乳状液激光共聚焦分析

大豆乳状液样品的激光共聚焦显微镜测定在室温下进行,采用Ar/K和He/Ne双通道激光模式,激发光的波长分别是488 nm和633 nm。分别将质量分数为0.01%的尼罗红和质量分数为0.01%的尼罗蓝溶解在异丙醇中,制成染色液。取1 mL乳状液样品,分别加入40 μL尼罗红染色液和40 μL尼罗蓝染色液,混合均匀后,染色20 min,取染色后的乳状液样品1滴放在带凹槽的载玻片上,盖上盖玻片并用甘油密封。采用油镜进行图像的采集,观察的分辨率为1 024×1 024,图像采集的范围为5~45 μm。

1.2.5 乳状液中蛋白质的提取

乳状液中蛋白提取方法采用丙酮沉淀法[9]。冰丙酮与乳状液按照质量体积比20 ∶1的比例混合,在-18℃下放置2 h,在4℃、12 000g下离心15 min,除去上清液,沉淀用冰丙酮洗涤至溶剂由黄色变成无色,将沉淀中溶剂挥发后冻干得到蛋白,放入4℃冰箱备用。

1.2.6 乳状液中蛋白质相关研究

1.2.6.1 红外光谱的测定

利用傅里叶红外光谱仪对乳状液蛋白的红外吸收光谱进行采集。测定条件:25℃下,扫描范围400~4 000 cm-1,分辨率为4 cm-1,扫描信号累加64次。

1.2.6.2 荧光光谱的测定

依据尹寿伟[10]的方法。将蛋白样品分别分散于0.01 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)中,配制蛋白质量浓度为0.15 mg/mL的溶液。荧光发散光谱分析以蛋白质分子内部的色氨酸荧光基团为探针,为了降低酪氨酸的贡献,荧光光谱的激发波长为290 nm,光谱的扫描范围为300~400 nm,激发与发射狭缝的宽度均为5 nm。

1.2.6.3 SDS-PAGE电泳分析

样品溶于0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)中,质量浓度为15 mg/mL、20 μL的样品溶液与10 μL上样缓冲溶液混合均匀后,在100℃下加热90 s,电泳上样量为10 μL,浓缩胶和分离胶的浓度分别为5%和15%,初始电压为80 V,待样品进入分离胶后将电压调整为120 V,结束后取下胶块,用考马斯亮蓝进行染色,甲醇、冰乙酸进行脱色,利用凝胶成像仪对其进行分析。

1.2.6.4 表面疏水性的测定

依据Kato等[11]的方法,即ANS荧光探针法。将一定量的乳状液蛋白溶于0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)中,室温搅拌1 h,使样品充分溶解,在10 000g下离心30 min,用Lowry法测定上清液中蛋白质含量,梯度稀释,使其浓度范围在0.005~0.5 mol/L,40 μL 8 mmol/L的ANS溶液置于4 mL不同浓度的样品中,充分混匀后静置5 min,测定样品的荧光强度(FI),激发波长为370 nm,发射波长为490 nm,狭缝宽度为5 nm。以荧光强度和蛋白质浓度作图,初始段的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数(S0)。

1.2.7 数据分析

为保证试验数据的准确性,每组试验进行3次重复试验,并将试验数据进行误差分析。采用SPSS 19统计软件进行单因素方差分析和差异显著性分析,采用Origin 8.5软件进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 不同pH条件下乳状液的粒径分布和Zeta电位分析

图1为不同pH条件下乳状液的粒径分布。

图1 不同pH条件下乳状液的粒径分布

由图1可知,乳状液的粒径主要呈双峰粒度分布,主要集中在0.5~10 μm和10~100 μm,其中pH在2、4、5、6时,乳状液的粒径分布主要集中在10~100 μm,而pH在8、10时,乳状液的粒径分布比较广,在pH 5时有最大的粒径。Xiong等[12]探究不同pH下卵清蛋白/壳聚糖混合物在油水界面的乳液稳定性,发现在pH 5.5时,乳液的粒径分布变大,乳液发生聚集。这一结论与本文的研究一致,产生这种现象可能是因为在pH 5左右为蛋白质的等电点,蛋白质发生沉淀,使乳状液粒径增大[13]。

图2为不同pH条件下乳状液的Zeta电位。

图2 不同pH条件下乳状液的Zeta电位

由图2可知,pH在8、10时的Zeta电位分别为-23.5 mV和-28.8 mV,表明乳状液具有较强的稳定性,在pH为4.5~4.7的范围内乳状液的Zeta电位接近于0,说明乳状液在pH 4.5~4.7的范围内稳定性最低, Li等[14]研究了花生乳状液的电位变化,发现在pH 8~9时,花生乳状液的电位为-36.60 mV,乳状液具有较好的稳定性,而在pH 3~5的范围内乳状液的电位较低,稳定性较差,这一结果与本文的研究一致。产生这种现象的原因可能是由于乳状液中的蛋白质在等电点附件发生聚合,导致蛋白质不能包裹住油滴,使乳状液的稳定性降低。

2.2 不同pH条件下乳状液微观结构分析

图3为不同pH条件下乳状液的激光共聚焦图。由图3可知,pH的变化对乳状液的微观结构具有显著影响。随着pH的增加乳状液中油滴的尺寸呈现先增大后减小的趋势,在pH为6时油滴达到最大,蛋白质形成的界面膜完全被破坏,油滴发生聚集。同酸性条件下的乳状液相比,碱性条件下油滴尺寸更小,且分布均匀,呈现出均匀稳定的外观。这些结果说明在pH接近蛋白质等电点时,乳状液稳定性最差,油滴易于聚集形成大油滴。此外,碱性条件下比酸性条件下油滴尺寸更小,且分布更均匀,说明碱性条件下乳状液的稳定性更好。Li等[14]观察了花生乳状液的显微结构,发现在花生蛋白的等电点处油滴尺寸较大,该结论与本文的结果相一致。表明乳状液在等电点处出现失稳现象。

注:a.pH 2;b.pH 4;c.pH 5;d.pH 6;e.pH 8;f.pH 10。

图3 不同pH条件下乳状液的激光共聚焦图

2.3 不同pH条件下乳状液中蛋白质的分析

2.3.1 表面疏水性

图4为不同pH条件下乳状液中蛋白质的表面疏水性。

图4 不同pH条件下乳状液中蛋白质的表面疏水性

由图4可知,不同pH条件下乳状液中蛋白质的表面疏水性具有显著差异,pH为5的乳状液中蛋白质的表面疏水性最低,当pH远离蛋白质等电点时,表面疏水性逐渐增加,这是由于pH远离等电点会增加蛋白质表面相同的电荷,使分子间静电排斥作用增强,引起蛋白质分子结构展开,暴露出更多分子内部的疏水基团,导致表面疏水性增加[15]。在碱性条件下的乳状液中蛋白质的表面疏水性大于酸性条件下的,这可能是由于在碱性条件下,大豆蛋白中少量的植酸发生解离[16],这会使蛋白质具有更高的电负性,增加了分子间的排斥力,使蛋白质分子展开程度增大,暴露出更多的疏水残基,导致碱性条件下具有更高的表面疏水性。表面疏水性的增加可以使更多的疏水基团暴露,蛋白质结构舒展,使得蛋白质更容易吸附在油滴的表面增加乳状液的稳定性。

2.3.2 SDS-PAGE

图5为不同pH条件下乳状液中蛋白质的SDS-PAGE电泳图。

注:泳道M表示蛋白质标样Marker;泳道1~6分别表示pH为2、4、5、6、8、10的乳状液蛋白。

图5 不同pH条件下乳状液中蛋白质的SDS-PAGE电泳图

由图5可知,乳状液中蛋白质亚基相对分子质量主要分布在11~63 kDa范围内,此外还有一部分亚基分布在相对分子质量小于11 kDa处。pH为2的乳状液蛋白质亚基相对分子质量主要分布在11 kDa以下、11 kDa处和35 kDa处;当pH为4、5、6时,乳状液蛋白质电泳图中所有条带的颜色均加深,且分布在11 kDa和35 kDa处的亚基显著增加,这可能是由于在乳状液蛋白质等电点附近,蛋白质静电荷趋于0,使蛋白质产生聚集,导致相对分子质量增加[17]。pH为8和10的乳状液蛋白的电泳条带具有相似的变化趋势,所有的条带均变浅,且相对分子质量分布与pH为2的乳状液蛋白相近。以上结果表明,在pH接近乳状液蛋白质等电点时,由于界面蛋白质的静电荷趋于0,静电排斥作用较小,使蛋白质易于聚集,导致相对分子质量增加。

2.3.3 傅里叶变换红外光谱

图6为不同pH条件下乳状液中蛋白质的红外光谱图。

图6 不同pH条件下乳状液中蛋白质的红外光谱图

通过对不同pH条件下的乳状液中蛋白质的二级结构含量进行计算,结果发现不同pH处理对乳状液中蛋白质的二级结构含量具有显著影响(P<0.05)(见表1)。

由表1可见,随着pH的增加(pH 2~8),α-螺旋和β-转角含量呈先降低后增加的趋势,而β-折叠和无规卷曲含量呈先增加后降低的趋势。pH为5时α-螺旋结构的含量最低,为(10.7±0.11)%,无规卷曲结构的含量最高,为(28.6±0.15)%。这说明在蛋白质等电点附近蛋白质发生变性,蛋白质结构部分或全部展开,导致有序结构含量降低,无序结构含量增加;β-转角含量降低表明蛋白质的疏水区域暴露,导致表面疏水性增加[20],与图4的研究结果一致,表明在蛋白质等电点附近乳状液的稳定性较差。

表1 不同pH条件下乳状液中蛋白质的二级结构含量 %

注:表中不同字母表示同一列数值存在显著差异(P<0.05)。

2.3.4 乳状液中蛋白质色氨酸内源荧光光谱分析

图7为不同pH条件下乳状液中蛋白质的荧光强度及最大吸收波长。

图7 不同pH条件下乳状液中蛋白质的荧光强度及最大吸收波长

由图7可知,在pH为5时,乳状液中蛋白质的荧光强度最低,这可能与pH 5在蛋白质等电点附近有关。由pH 5为起始,无论pH向酸性还是碱性偏移,荧光强度均增加,最大吸收波长(λmax)与荧光强度的变化趋势相似,当pH为2~5时,λmax由(345.5±0.15)nm降低到(341.6±0.29)nm,当pH为5~10时,λmax由(341.6±0.29)nm增加到(348.0±0.37)nm,说明pH为5的乳状液中蛋白质的λmax最低,而当pH远离蛋白质等电点时,λmax发生了红移,这表明蛋白质三级结构变得更加松散,可能是当pH远离蛋白质等电点时,蛋白质肽链结构适当展开,蛋白质的分子柔性增加,使原本包埋在蛋白质内部的疏水残基暴露到极性环境中导致的[21],这在本文pH远离蛋白质等电点使蛋白质表面疏水性增加的结果中也可以得到证实。

3 结 论

通过考察不同pH下乳状液的粒径、Zeta电位、微观结构及其中蛋白质性质,研究pH对乳状液稳定性的影响机理。结果发现,pH主要是通过改变乳状液中蛋白质结构及性质改变乳状液的稳定性。在蛋白质的等电点附近,乳状液粒径增大,Zeta电位接近0,乳状液中蛋白质的二级结构发生变化,表面疏水性降低,从而使蛋白质结构松散,不足以稳定乳状液,使乳状液稳定性降低。

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