高效液相色谱检测鱼肉中游离棉酚含量方法的建立
2019-04-29
（河南师范大学水产学院，河南新乡453007）
我国是棉花种植大国，棉籽年产量达1000万t以上，压榨后所得棉籽饼产量高达600万t以上。棉籽粕的粗蛋白含量为35-40%，营养丰富、价格低廉，是畜禽、水产动物饲料源蛋白重要来源之一[1-2]。然而，由于棉籽粕中含有游离棉酚，长期摄食含有棉酚的饲料，游离棉酚会蓄积在动物体内，影响人类食用安全。有研究表明，人类食用含有棉酚的食物后可引起低血钾症、肝脏和肾脏损伤，甚至可造成女性月经紊乱、闭经，男性不育[3-8]。上世纪六十年代发生在山东高密、河南夏邑及河北邢台的男性不育现象，经调查发现与该地区长期食用土榨棉籽油有关[9]。对于游离棉酚在食品中的残留限量，世界卫生组织、联合国儿童基金会建议不超过600 mg/kg[10]，美国FDA规定不超过450mg/kg[11]，我国规定食用植物油中不超过200mg/kg[12]。关于植物性食品或饲料中游离棉酚检测方法已有较多报道[13-16]；动物性食品中游离棉酚检测方法仅见崔晓明等[17]研究报道，该方法采用高效液相色谱法（HPLC）检测了畜肉中游离棉酚含量，但其提取溶剂剂量相对较多，处理过程相对耗时。文献报道检测动物组织中游离棉酚仍多是采用饲料中游离棉酚检测方法[18-20]，前期样品处理过程比较繁琐，使动物性食品游离棉酚检测效率大大降低。相对禽畜肉，鱼肉中脂肪含量较低，无需繁琐的去脂肪过程。本研究建立了鱼肌肉中游离棉酚的高效液相测定方法，样品处理过程相对简单，准确度高，以期为鱼肉中棉酚安全评价提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
鲤鱼幼鱼，购于郑州某养殖场，体质量50-60 g，流水养殖，水温24-26℃。
1.1.2 药品与试剂
醋酸棉酚标准品（含量≥98.0%），购于大连美仑生物技术有限公司。甲醇、乙腈和磷酸均为色谱纯。
1.1.3 实验仪器
高效液相色谱仪Agilent 1260，Eppendorf高速离心机，ZG圆形水浴氮吹仪，XHF-DY内切式均浆机。
1.2 实验方法
1.2.1 色谱条件
高效液相色谱仪为Agilent 1260，色谱柱为Agilent TC-C18（长度250 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm）；流动相为甲醇:磷酸=85:15(v:v)，磷酸浓度0.01 mol/L，pH值2.43；紫外检测波长235 nm，柱温40℃，流速1.0 mL/min，进样体积20 μL。
1.2.2 磷酸溶液配制
准确量取580 μL 85%色谱级磷酸，用超纯水定容至1 L，磷酸浓度0.01 mol/L，测得pH为2.43。
1.2.3 不同溶剂溶解游离棉酚稳定性
纯丙酮溶液：准确称量醋酸棉酚0.0102 g，用纯丙酮定容至50 mL，超声波超声30 min，配置成200 μg/mL的棉酚标准储存液，再利用纯丙酮稀释成10 μg/mL的棉酚标准工作液。
丙酮-水溶液：准确称量醋酸棉酚0.0102 g，用70%丙酮水定容至50 mL，超声波超声30 min，配置成200 μg/mL的棉酚标准储存液，再利用70%丙酮水稀释成10 μg/mL的棉酚标准工作液。
丙酮-磷酸溶液：准确称量醋酸棉酚0.0102 g，用70%丙酮磷酸定容至50 mL，超声波超声30 min，配置成200 μg/mL的棉酚标准储存液，再利用70%丙酮磷酸稀释成10 μg/mL的棉酚标准工作液。
稳定性测定：每天上午10:00在1.2.1的色谱条件下分别测定纯丙酮、70%丙酮水、70%丙酮磷酸三种不同的游离棉酚溶液的响应值峰面积，连续测定5天后分别比较它们的变异系数(C·V%)，以此衡量各种溶液的稳定性。
1.2.4 醋酸棉酚标准溶液配制
准确称量醋酸棉酚0.0102g，用70%丙酮磷酸定容至50mL，超声波超声30min，配制成200μg/mL的棉酚标准储存液，再利用70%丙酮磷酸依次稀释成100μg/mL、50 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5μg/mL和1μg/mL的棉酚标准工作液。
1.2.5 回收率和精密度的测定
取浓度为1、5、10 μg/mL 的标准溶液加入到1 g空白组织中，组织匀浆机12000 r/min匀浆10 s，然后用2 mL丙酮清洗刀头2次，合并3次液体，漩涡振荡10 s，4500 r/min离心15 min，吸取上清液转移至新10 mL离心管中，置-20℃冰箱冷冻过夜。冰箱中取出后，4500 r/min离心10 min，取上清液至10 mL玻璃离心管中，30℃氮气吹干。残渣用1 mL丙酮-磷酸（7：3）溶液定容，漩涡振荡10 s，超声波超声5 min，0.22 μm有机滤膜过滤后置-20℃冰箱冷冻过夜，次日再次利用0.22 μm有机滤膜过滤后用于浓度测定。每个浓度设3个重复，测得各样品峰面积按标准曲线方程计算浓度，然后与理论浓度相比较。
将上述样品于1 d内分别重复进样5次，分5 d测定，计算各浓度水平响应值峰面积的变异系数，以此衡量检测方法的精密度。
1.2.6 棉酚标准曲线绘制
分别取100 μg/mL、50 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL和1 μg/mL的棉酚标准溶液100 μL加入到1 g空白组织中，每个浓度设三个重复，按照前述“提取量”方法处理。以质量浓度作为横坐标，以峰面积作为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.7 样品制备与处理
准确称取醋酸棉酚标准品0.0969 g，加入10 mL灭菌生理盐水，超声波超声30 min，配制成9.686 mg/mL悬浊液，吸取0.1 mL灌胃，以20 mg/kg体质量剂量每天灌胃1次，连续灌5天。将鲤鱼解剖，取肌肉冷冻保存，备用。
准确称量鱼肉样品1 g（精确到0.01 g）于10 mL离心管，加入2 mL丙酮，组织匀浆机12000 r/min匀浆10 s，然后用2 mL丙酮清洗刀头2次，合并3次液体，按照前述1.2.5方法处理。
2 实验结果
2.1 峰形判别
在本实验条件下，醋酸棉酚色谱峰峰形良好，棉酚保留时间在17.2 min左右，如图1所示。
2.2 标准曲线
图1游离棉酚色谱图
本实验条件下，醋酸棉酚在0.5～10 μg/g范围内有良好的相关性，鱼肉中游离棉酚标准曲线方程为Y=59.446X-3.5888(R2=0.9981)，如图2所示。最低检测限为0.5 μg/g。
2.3 稳定性
图2 肌肉中游离棉酚标准曲线
由表1可知，同用纯丙酮和70%丙酮水配制而成的棉酚相比，70%的丙酮磷酸配制而成的棉酚溶液的变异系数最低为2.25%，所以其稳定性最好。
2.4 准确度和精密度
表1 不同提取溶剂溶解游离棉酚稳定性差异
在本实验条件下，肌肉中加入1 μg/g、5 μg/g、10 μg/g三个浓度游离棉酚标品后，回收率均高于96%，变异系数小于10%，符合生物测定方法要求。
2.5 样品检测
表2 鱼肉中游离棉酚检测回收率和精密度
按体质量以20 mg/kg剂量连续5d口灌鲤鱼游离棉酚后，测定其肌肉中棉酚含量，峰面积为53.22（图1），带入标准曲线计算得0.96 μg/g。
3 讨论
游离棉酚属于易氧化的亲脂性化合物，结构中含有共轭双键，具有较强的紫外吸收，因此可利用紫外检测，测定方法有苯胺法、间苯三酚法[21]、高效毛细管电泳法（HPCE）[22]、高效液相色谱法（HPLC）[23]和高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS/MS）[24]。与苯胺比色法、间苯三酚法和HPCE法相比，HPLC和UPLC-MS/MS灵敏度高，但UPLC-MS/MS检测成本较高，目前主要采用HPLC测定游离棉酚。栾姝等[14]以甲醇-1%磷酸作为流动相，丙酮、乙醚、甲醇作为提取溶剂，比较了三种提取剂提取棉籽仁中游离棉酚的提取率，结果显示丙酮提取率最高。陈来等[15]利用丙酮提取棉籽粕中游离棉酚，经超声、离心、抽滤、旋转蒸发处理后，以乙腈-0.2%磷酸作为流动相检测棉酚含量，稳定性好、灵敏度高。刘扬等[16]以甲醇作为提取溶剂，提取食用植物油中游离棉酚，上清液用氮气吹干后用乙腈-0.1%甲酸定容，经过C18柱分离，以乙腈-0.1%甲酸水作为HPLC流动相，可准确检测食用植物油中棉酚含量。邸万山[25]以BHT为内标物，通过HPLC也可准确测定棉籽油中游离棉酚含量。姚军等[26]以丙酮-乙腈-正庚烷-磷酸盐溶液作为提取剂，提取家兔血浆中游离棉酚后离心取上清，微孔滤膜过滤后直接进行HPLC测定，无需进行蒸干浓缩，操作简单，可用于棉酚在动物体中蓄积及毒性评价。
关于动物食品中游离棉酚测定尚未有国标方法，仅见崔晓明等[17]建立了一种HPLC测定肉样中游离棉酚含量的方法，该方法取5 g肉样，每次用25 mL丙酮-水重复提取两次，冰箱中冷藏过夜，之后利用旋转蒸发浓缩定容，取上清测定。而水产动物肌肉中游离棉酚含量测定多采用的是GB 13086-1991《饲料中游离棉酚的测定方法》中的苯胺比色法[18,20]。根据栾姝等[14]研究结果，本方法在选取1 g样品条件下，优化了丙酮提取剂量，确定了丙酮最佳提取剂量，有效降低了检测成本。同时采用组织匀浆机破碎组织，与超声破碎相比，速度快，效果好。而在去脂肪步骤，参考崔晓明等[17]报道方法，本实验将上清液置于-20℃冻存12 h后再进行离心，由于鱼肉中脂肪含量较低，通过本方法即可有效去除脂肪，其费用远远低于使用C18柱去除脂肪成本。当长期摄食含有棉酚的饲料后，肌肉中游离棉酚含量较低，在30-50 μg/g[18,20]。本方法准确度高，变异系数小，最低检测限达0.5 μg/g，满足鱼肉中游离棉酚定量检测，可为鱼肉中游离棉酚安全评价提供技术支撑。
