乌苏里拟的人工繁殖技术总结

2019-04-29赵道全李先明谢国强武慧慧陈军平邵嘉棋刘方磊张莹莹张凤枝

河南水产 2019年1期

赵道全，李先明，谢国强，武慧慧，陈军平，邵嘉棋，刘方磊，张莹莹，张凤枝

（1.河南省水产科学研究院，郑州450044；2.河南师范大学，河南新乡453007）

乌苏里拟鲿（Pseudobagrus ussuriensis），隶属于硬骨鱼纲、鲶形目、鲿科、拟鲿属。特种中型经济鱼类，习底栖性，生活于水流缓慢的河道中。该鱼野生环境中主要以底栖动物为食，3年可性成熟，体长20 cm左右，产卵期在6月中至7月末，怀卵量较少。是该科鱼类中生长速度最快的种类，最大个体长度可达1 m。其脂肪含量高，肉质细嫩，味道鲜美，具有很高的食用价值和经济价值。

1 亲鱼培育

1.1 池塘条件

亲鱼培育池塘位于郑州市惠济区黄河滩区东部，水泥板护坡，沙泥塘底，地下水水源，进排水方便，池塘面积2334㎡，水深保持在1.5～2.0 m。

1.2 亲鱼放养

共放养乌苏里拟鲿300 kg，2940尾，放养亲本各项指标如表1。

表1 放养拟鲿亲本情况表

1.3 亲鱼驯养

驯养亲鱼用黄颡鱼专用饲料，漂浮性饲料，饲料台下设置2 m×2 m PVC管方框，饲料洒于方框之中，每天早上、傍晚各喂一次，将鱼驯化到水面抢食，每次掌握量以鱼不强烈抢食为止。

1.4 亲鱼的选择

亲鱼雌鱼挑选出腹部膨大，仰腹可见卵巢轮廓（生殖突较短），生殖孔扩张（宽而圆），手摸鱼腹部松软且富有弹性，体表无伤，体重100 g以上的个体；雄鱼腹部不膨大、尾柄细长，生殖突尖而细长，生殖孔闭锁，精巢呈锯齿状[1]，不易挤出精液，体质健壮，体表无伤，体重在250 g以上的雄性亲鱼。

2 亲鱼催产剂的注射

亲鱼的催产是人工繁殖的重要环节。催产的水温一般在20℃以上（最好稳定在22～24℃范围内）时，对亲鱼进行催产[2-3]。采取胸腔两次注射，进针深度1 cm左右。注射分两次进行，第一针下午17∶00～18∶00，剂量为每千克雌亲鱼注射LRH-A215～20 ug+HCG 10 IU，雄鱼减半；针距12 h，第二天早5∶00～6∶00打第二针，剂量为LRH-A215 ug+HCG 800IU，雄鱼减半。水温20～24℃时，效应时间为24 h左右。注射完毕之后需要给予亲鱼流水刺激，池中保持微流水，流量在10～30 m3/h，以便更好催产成功，注水期间应时常注意水不能溢出池子。池中溶解氧保持大于5.5 mg/L。保持环境安静，避光。

3 人工授精

由于拟鲿亲鱼发情行为不明显，在催产24 h左右以后，开始人工授精，对成熟好的雌鱼捕出挤卵（卵为橘黄色，卵径平均2.0 mm）进行半干法人工授精。挤卵时应注意不能把池水带入盆中，以免影响受精率。用提前保存好的精子适量洒在挤出的卵中，用硬鸡毛不停的搅拌，使精卵更好地结合受精。

精子保存液研制是拟鲿人工繁殖规模化关键，我们进行了深入研究，取得突破性进展。

3.1 材料和方法

试剂：吖啶橙（AO）染液、盐酸、Hanks精子保存液（商品购买）、hnscz精子保存液（自配优选）。

样本：取精子研磨，分别取Hnscz和Hanks精子保存液各8 min，显微镜观察后稀释精液，根据实验设计时间段，提前按4 h、96 h、144 h稀释好后分别用试管标号放置于4℃冰箱冷藏保存待用[4-6]。

分别取Hnscz和Hanks保存的4 h、96 h、144 h精子各30 uL；加盐酸吸液80 uL（反应30 s）；加AO染色液100 uL（反应3 min）；上机（贝克曼Cyto FLEX流式细胞仪）检测[7]。

人工授精实验分别取不同保存时间的精子与人工催产后挤出的乌苏里拟鲿卵授精，把受精卵分别按标号放入孵化框，在孵化槽中孵化5h统计受精率。

3.2 结果与分析

3.2.1 Hnscz保存的精子上机测试结果如下图

图1 自制精子保存液保存精子上机测试图

3.2.2 Hanks保存的精子测试结果如下图

图2 Hanks精子保存液保存精子上机测试图

3.3 实验分析

3.3.1 断裂指数分析

在FSC/SSC图上圈出精子细胞，在FL1(FITC)/FL3(ECD)散点图上进行分析。DNA完整性好的精子主要发绿色荧光(P2门)；DNA完整性差的精子主要发红色荧光(P4门)。通过公式计算DNA断裂指数at来评价精子DNA质量，断裂指数越小，精子质量越高。αt=red/(red+green)[7]。

从实验测试图形和数据得出以下结果：

Hnscz:

at1=6.37÷(39.03+6.37)=0.14

at2=11.28÷(40.65+11.28)=0.21

at3=9.48÷(23.23+9.48)=0.29

Hanks:

at1=9.44÷(32.10+9.44)=0.23

at2=8.29÷(17.18+8.29)=0.32

at3=18.85÷(38.54+18.85)=0.32

从以上断裂指数结果来看，我们配置的Hnscz精子保存液保存的精子比购买的Hanks精子保存液保存的精子的断裂指数小：Hnscz at1＜ Hanks at1；Hnscz at2＜Hanks at2；Hnscz at3＜ Hanks at3。说明自己研制的精子保存液Hnscz优于商业购买的Hanks精子保存液。

3.3.2 实验验证分析

表2 二种精子保存液实用效果对照

人工授精实验结果显示，Hnscz保存的精子144 h受精率81.4%，保持较高水平，与流式细胞仪测试的DNA断裂指数Hnscz at3=0.29较低水平的结果相吻合；而Hanks保存的精子144 h受精率11.5%，已达到很低水平，不适宜在实际人工繁殖使用，与流式细胞仪测试的DNA断裂指数Hanks at3=0.32较高水平的结果一致。

3.3.3 镜检观察

显微镜观察[8-9]，Hnscz保存液保存的精子6 d精子活力还旺盛，7 d活力开始减弱，9 d死亡；Hanks保存液保存的精子1 d、2 d活力较强，4 d活力减弱，5 d死亡。

3.4 结论

3.4.1 SCSA(断裂指数分析)判定精子质量好坏快速准确，并能量化分析，是人工保存精子使用前检测精子活力强弱的重要手段。

3.4.2 乌苏里拟鲿精子保存液Hnscz经SCSA分析和实际应用检验，在4℃冰箱中可以人工保存一周时间并保持精子活力旺盛，是实现规模化繁殖的保证。

3.4.3 对于乌苏里拟鲿人工保存的精子来说，根据参考资料和测试实验结果分析认为，DNA断裂指数at≤0.15则精子活力旺盛，保存的精子可以作为人工授精的精子来源。DNA断裂指数at≥0.3则精子趋于衰竭，不再作为人工授精的精液来源。

4 孵化与出苗

4.1 孵化

受精卵孵化框中孵化，每4个孵化框放在一个孵化槽中，每个框放受精卵1万粒，孵化槽采用微流水、充气方式，每天彻底换水1次。孵化水温保持在20℃以上，最好在22～24℃之间，孵化期间保持微流水状态，溶解氧在6.0 mg/L以上，而在出水口一端，应不断给过滤网进行刷洗，以免阻塞。在孵化到35 h左右时，应给网片消毒一次，采用福尔马林溶液浸泡约60 s左右，取出放入新的孵化池中，防止霉菌发生；同时要避免阳光直射。在孵化水温20～24℃时，从受精到出膜时间为60～70 h，孵化积温均在60～68℃·d范围内。

4.2 出苗

当仔鱼全部孵出后，刚孵化出膜的仔鱼聚集在孵化框的四个角落，全长仅为6.0 mm左右，形似蝌蚪，卵黄囊硕大并以其为营养，体质弱嫩，不能自由游泳；继续暂养5～7 d后，仔鱼全长可达1.0 cm,卵黄囊大大缩小，仔鱼开始开口摄食，此时可进行鱼苗培育，但暂养时，要求水质清洁、溶氧充分，还要避免阳光直射。

表3 繁殖实验获苗数量表

从我们繁殖5批次获苗数量看，繁殖技术在不断提高、成熟。

5 鱼苗培育

鱼苗培育主要是将水花培育成2.5～3.5 cm的夏花鱼苗，可选择在水泥池和池塘中进行，本文以池塘培育作介绍。

5.1 池塘消毒

选择水质良好水源充足无污染的鱼池，面积1500～2000 m2，消毒须选择晴天进行，放养前6～8 d，用生石灰50～75 kg/667㎡或漂白粉7～10 kg/667㎡溶解化浆后全池泼洒。鱼塘消毒5 d后将水加至60～70 cm，施基肥150～200 kg/667㎡腐熟的牛粪，以培肥水质，增加水中生物饵料[10-11]。

5.2 放养密度

池塘投放密度5～6万尾/667 m2的水花，投放一定数量的鲢、鳙鱼夏花或鱼种，鲢、鳙比例为3：1，以调节水质。

5.3 投喂

采用肥水（浮游动物大量繁殖）下塘与人工投喂饲料相结合的饲养技术。鱼苗下塘后以人工培养的浮游动物为食，约可维持5 d左右，从第5 d开始进行人工投喂，在以后的5 d内靠岸边泼洒豆浆，每日4次，每次25 kg/667 m2左右；而在达第10 d时可以开始泼洒豆浆与粉料的混合料，每日4次，每次30 kg/667 m2左右，每桶中加入一碗粉料混匀即可；在喂养达15 d时可完全泼洒粉料，每日4次。同时还需要根据天气变化，鱼苗的摄食情况灵活调整投喂量；而在投喂时可适当的加入微生物制剂如光合细菌等作为饲料添加剂，一方面可防止水体恶化，同时也可以增强鱼体抗病率。加强培育期间的水质管理，定期加注新水[13-14]。