OmpR对伤寒沙门菌侵袭上皮细胞能力的影响

林立萍，张连璐，易周易，赵雅闻，李雪，唐浩，黄新祥，张盈

（江苏大学医学院，江苏 镇江212013）

伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi）是一种革兰阴性兼性胞内寄生兼性厌氧菌，感染机体后可以引起胃肠炎或伤寒［1］。S.Typhi感染过程分为两个阶段：细菌黏附并侵入小肠上皮细胞，为肠道感染阶段；细菌进入上皮细胞或巨噬细胞内，然后在胞内复制，为细胞内感染阶段［2-3］。该过程所需的相关基因位于沙门菌致病岛（salmonella pathogenicity island，SPI）。S.Typhi表达两个不同的Ⅲ型分泌系统（T3SS），能在感染后将效应蛋白注入宿主细胞：一个是SPI-1，其效应蛋白与细菌和宿主细胞的黏附有关，可引起肠黏膜细胞的肌动蛋白发生重排，有利于S.Typhi内化［4］，能够促进沙门菌进入和侵袭上皮细胞。另一个是SPI-2，其在吞噬细胞内具有活性，且为吞噬体生存所必需。以往研究表明［5］，EnvZ／OmpR双组分系统参与SPI-1基因表达的调控，OmpR-P能够直接与hilC和hilD启动子结合，激活前者并且抑制后者基因的表达，从而影响S.Typhi对上皮细胞的侵袭力。本研究利用ompR缺陷株（ΔompR），分析OmpR对S.Typhi侵袭上皮细胞能力的影响，并进一步选择SPI-1中3个操纵子首基因iagA、invF、prgH，研究其相关分子机制以探讨OmpR在S.Typhi侵袭过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

S.Typhi野生株GIFU10007（WT）为日本岐阜大学医学院微生物学教研室馈赠。S.Typhi的ΔompR菌株由本实验室制备及保存［6］。大肠埃希菌DH5α由本实验室保存。HeLa细胞购自上海生科院细胞库。

胰蛋白胨、酵母提取物、氯霉素、胰蛋白酶、胎牛血清（英国Oxoid公司）；无水乙醇、异丙醇（上海国药集团化学试剂有限公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；SYBR荧光定量试剂盒、反转录试剂盒、DNA酶Ⅰ快速DNA消化试剂盒、T4DNA连接酶、限制性内切酶、DL 2000 DNA标准参照物（大连TaKaRa公司）；凝胶阻滞实验（EMSA）上样缓冲液（碧云天生物技术有限公司）；质粒提取试剂盒（上海生工生物技术服务有限公司）；细胞培养板（美国Corning公司）。

2720型PCR仪（美国ABI公司）；核酸紫外检测仪（Eppendorf公司）；荧光定量PCR仪（美国Biorad公司）；凝胶成像系统（基因有限公司）；电转化仪（美国Bio-Rad公司）；高速冷冻离心机，CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物 实验中所用引物由苏州泓讯生物科技有限公司合成，序列见表1（下划线示酶切位点）。

表1 引物名称及相应序列

1.2.2 ompR基因缺失回补株的制备 以WT基因组DNA作为模板，以ompR-C-F／R为引物进行PCR扩增，并纯化回收；利用限制性内切酶XbaⅠ和Hin dⅢ对上述PCR产物和载体pBAD33质粒纯化产物分别行酶切处理，用DNA连接酶进行连接；连接产物热击转化入大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，用含氯霉素的LB平板进行筛选，挑取转化后的单菌落过夜培养，苯酚和氯仿抽提各菌落基因组行电泳鉴定，初步筛选阳性克隆。提取所筛选的质粒，以内部引物对ompR-C-F和ompR-C-R、交叉引物对ompR-C-F和pBAD33-R分别进行PCR扩增，进一步验证阳性质粒是否连接目的片段。经PCR验证正确后，经基因序列分析（由苏州泓讯生物科技有限公司完成）验证。提取序列正确的重组质粒（ompRpBAD33），并将其电转入ΔompR中，即可得ompR基因缺失回补株（记为C-ΔompR）。同时将空载体pBAD33转入WT和ΔompR中作为相应的对照株（分别记为WT-pBAD33和ΔompR-pBAD33）。

1.2.3 HeLa细胞侵袭实验 用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2培养箱内培养HeLa细胞，在实验前1 d将细胞以1×105／mL密度接种于24孔中，于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h。将WT-pBAD33、ΔompR-pBAD33和C-ΔompR于20 mL LB培养基中，250 r／min，37℃培养至对数早期［D（600 nm）＝0.4］。按照MOI为20∶1的比例向细胞中加入细菌，孵育90 min；弃上清液，PBS洗3次。一半孔内加入0.5%（v／v）Triton X-100裂解细胞，孵育12 min后涂于LB平板，培养过夜，其克隆数代表黏附水平（以T0表示）；余下一半孔内加入100 μg／mL庆大霉素杀死胞外菌，继续培养90 min后同样加入0.5%（v／v）Triton X-100裂解细胞，过夜培养，计算单克隆数代表侵袭水平（以T90表示）；重复3次后进行数据分析。

1.2.4 荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测侵袭相关基因的mRNA表达水平 选择SPI-1中3种侵袭相关基因iagA、invF、prgH行qRT-PCR分析。将WT-pBAD33、ΔompR-pBAD33单菌落分别接种于2 mL LB培养基，37℃、250 r／min振荡培养过夜。次日，将种子液以1∶100比例转接至20 mL LB，相同条件培养至稳态期［D（600 nm）＝2.0］。将培养的WT-pBAD33和ΔompR-pBAD33于4℃行4 000 r／min离心收集沉淀。Trizol法提取细菌总RNA，使用DNA酶ⅠDNA消化试剂盒消化基因组DNA。取1 μg总RNA，以特异性下游引物和反转录试剂盒进行反转录。以cDNA为模板，用上下游引物进行扩增，采用两步法qRT-PCR（95℃预变性150 s，95℃10 s，65℃30 s，40个循环），其中16 SrRNA为内参基因（引物见表1），观察相关基因在各菌株中的转录水平。实验重复3次；Bio-Rad CFX Manager软件整理和分析数据，利用相对定量法确定mRNA的相对表达水平。

1.2.5 EMSA 以WT基因组DNA为模板，PCR扩增iagA、invF、prgH基因启动子区序列并纯化，16 S DNA用作阴性对照（引物见表1）。在结合缓冲液中加入20 mmol／L新鲜乙酰磷酸盐，并与纯化的His-OmpR蛋白一起室温放置10 min以实现OmpR磷酸化；结合体系配制完成后，分别加入1μL DNA片段于30℃温育30 min；产物行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用溴化乙啶染色，于凝胶成像仪显影后分析结果。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0统计软件分析数据，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 C-△ompR制备

2.1.1 重组质粒的构建及鉴定 PCR扩增获得752 bp ompR目的片段（图1a）。以内部引物对和交叉引物对进行PCR扩增筛选阳性克隆，相应扩增片段长度与理论值（分别为752 bp和802 bp）一致（图1b）；挑取PCR鉴定正确的克隆经基因序列分析验证，该质粒所连接的目的片段不存在缺失、插入等突变，表明重组载体构建成功。

图1 重组质粒的构建及鉴定

2.1.2 C-△ompR的验证 以C-ΔompR基因组为模板的扩增片段与理论值（分别为802 bp、874 bp和924 bp）一致；而以双蒸水为模板均扩增不出条带，表明阳性重组质粒成功导入ΔompR中，回补株制备成功。见图2。

图2 回补株PCR鉴定凝胶电泳图

2.2 OmpR增强S.Typhi侵袭上皮细胞的能力

如图3所示，与WT-pBAD33相比，ΔompRpBAD33对HeLa细胞的侵袭能力显著下降，而CΔompR侵袭能力较ΔompR-pBAD33明显升高（P均＜0.01），说明OmpR可促进S.Typhi对上皮细胞的侵袭。

2.3 OmpR增加侵袭相关基因的表达

qRT-PCR结果显示，ΔompR-pBAD33中侵袭相关基因iagA、invF、prgH的转录水平较WT-pBAD33明显降低（P均＜0.01，图4）。由此表明，OmpR正向调控S.Typhi侵袭上皮细胞相关基因的转录。

图3 ompR缺陷对S.Typhi侵袭上皮细胞能力的影响

图4 OmpR对侵袭相关基因表达的影响

2.4 OmpR直接和prgH启动子区域结合

EMSA结果显示（图5），His-OmpR以剂量依赖性方式与prgH的启动子区域结合，但其与iagA和invF基因启动子区域以及阴性对照16 SDNA未有结合。

图5 Omp R直接和prgH启动子区域结合

3 讨论

S.Typhi是一种原核生物，可引起人类全身系统性感染——伤寒热［7］。S.Typhi感染机体引起疾病的过程很大程度上依赖于其通过污染的食物和水经消化道感染宿主，进入宿主后侵入肠上皮细胞并在巨噬细胞内存活的能力［8］。S.Typhi的致病能力与多种侵袭、菌毛、鞭毛基因以及调节因子等相关，其中影响入侵过程的主要毒力因子由SPI-1编码。

OmpR是双组分调节系统EnvZ／OmpR的调节蛋白，是一种中央调节因子，其经传感器激酶EnvZ磷酸化激活，由此产生的OmpR-P调节许多具有不同细胞途径的基因［9］，如外膜孔蛋白、鞭毛基因、菌毛以及Vi抗原。以往研究表明［6，10-11］，在SPI-1编码的4种AraC样转录因子HilA，HilC，HilD和InvF中，OmpR-P能够直接与hilC和hilD启动子结合，激活前者并且抑制后者，HilC和HilD控制自身与其转录，并一起激活hilA转录，HilA进一步激活invF的转录，从而影响S.Typhi对上皮细胞的侵袭力。本文以ompR基因作为研究对象，构建了回补株CΔompR，对OmpR在S.Typhi侵袭上皮细胞中的功能进行研究，发现ompR的缺失能显著降低S.Typhi对HeLa细胞的侵袭能力，而C-ΔompR侵袭能力只是部分恢复，可能与回补基因的表达量有关。

SPI-1中含有inv、hil、org、spt、sip、iag、iae、prg等基因［12］，编码T3SS的各种成分，其中T3SS分泌装置注射体的子结构主要由3种完整的膜蛋白InvG，PrgH和PrgK组成［13］，它们通过形成环状结构从而分泌各种成分。本实验选择SPI-1中3个操纵子首基因iagA、invF、prgH，通过qRT-PCR发现OmpR可促进这些侵袭相关基因的转录。进一步采用EMSA，通过在纯化的His-OmpR蛋白中加入新鲜乙酰磷酸盐，实现OmpR的体外磷酸化。结果显示，OmpR-P可直接与prgH基因启动子区域结合，与iagA和invF基因启动子区域未有结合。PrgH是T3SS分泌装置注射体的组成部分，参与T3SS基座内环的构成。本研究结果表明OmpR可直接调节T3SS结构相关基因的表达。

综上所述，OmpR能够通过直接调节prgH和间接调节iagA、invF增加侵袭相关基因的表达，从而增强S.Typhi对上皮细胞的侵袭力。然而，本研究结果虽表明prgH是OmpR的靶基因，但是OmpR与prgH的结合位点仍需进一步确定。