Th17/Treg细胞失衡与溃疡性结肠炎患者疾病活动度及炎症程度的关系

何智超 林楠 尹丕发

[摘要] 目的 研究Th17/Treg細胞失衡与溃疡性结肠炎（UC）患者疾病活动度及炎症程度的关系。 方法 选择从2017年1月～2018年5月在云南省老年病医院（以下简称“我院”）诊治的UC患者93例进行研究，UC活动期者56例为活动期组，UC缓解期者37例为缓解期组。根据改良Mayo评分将活动期组划分亚组：轻度组19例、中度组24例、重度组13例。另选取同期在我院进行健康体检的40名志愿者作为对照组。检测并比较各组Th17/Treg、C反应蛋白（CRP）、白细胞介素（IL）-10及IL-17水平，分析患者Th17、Treg细胞与疾病活动度及炎症程度的关系。 结果 活动期组及缓解期组的Th17细胞比例及Th17/Treg水平较对照组高，且活动期组较缓解期组高（P < 0.05），活动期组的Treg细胞比例较对照组低（P < 0.05）。重度组的Th17/Treg水平较轻度组和中度组高，且Th17细胞比例较轻度组高（P < 0.05），Treg细胞比例较轻度组和中度组低（P < 0.05）。活动期组及缓解期组的CRP及IL-17水平较对照组高，且活动期组较缓解期组高（P < 0.05）。活动期组及缓解期组的IL-10水平较对照组低（P < 0.05）。重度组的CRP及IL-17水平较轻度组高，IL-10水平较轻度组低（P < 0.05），重度组的CRP水平较中度组高，且中度组较轻度组高（P < 0.05）。Pearson相关性分析结果，Th17细胞及Th17/Treg与疾病活动度、CRP及IL-17均呈正相关，与IL-10呈负相关（P < 0.05）。Treg细胞与疾病活动度、CRP及IL-17均呈负相关，与IL-10呈正相关（P < 0.05）。 结论 UC患者机体中Th17/Treg细胞失衡与其疾病活动度及炎症程度之间存在密切关系，临床上应尽可能地确保患者的Th17/Treg细胞平衡，从而有利于其病情防控。

[关键词] Th17/Treg细胞失衡;溃疡性结肠炎;疾病活动度;炎症程度;关系

[中图分类号] R574.6          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（b）-0130-04

[Abstract] Objective To study the relationship between the imbalance of Th17/Treg cells and the degree of disease activity and inflammation in patients with ulcerative colitis （UC）. Methods Ninety-three patients with UC from January 2017 to May 2018 admitted to Yunnan Geriatric Hospital （“our hospital” for short） were selected and studied. Among the patients， 56 cases in UC active period were as the active period group， 37 cases in remission period were as the remission period group. The active stage group was divided into subgroups according to the modified Mayo scoring： 19 cases in the mild group， 24 cases in the moderate group， and 13 cases in the severe group. Another 40 healthy volunteers undergoing physical examination in the same period were selected as the control group. The levels of Th17/Treg， C-reactive protein （CRP）， interleukin （IL）-10， IL-17 were detected and compared. Th17， Treg cells in each group were measured and the relationship between Th17， Treg cells and disease activity and inflammation was analyzed. Results The proportion of Th17 cells and the level of Th17/Treg in the active period group and the remission period group were significantly higher than the control group， and those in the active period group were significantly higher than the remission period group （P < 0.05）， and the proportion of Treg cells in the active period group was significantly lower than the control group （P < 0.05）. Th17/Treg level in the severe group was significantly higher than the mild group and moderate group， and the proportion of Th17 cells was significantly higher than the mild group （P < 0.05）. The proportion of Treg cells in the severe group was significantly lower than the mild group and moderate group （P < 0.05）. The CRP and IL-17 in the active period group and the remission period group were significantly higher than the control group， and the CRP and IL-17 in the active period group were significantly higher than the remission period group （P < 0.05）. The IL-10 in active period group and remission period group was significantly lower than the control group （P < 0.05）. The CRP and IL-17 in the severe group were significantly higher than the mild group （P < 0.05）. The CRP in the severe group was significantly higher than the mild group， and the CRP in the severe group was significantly higher than the mild group （P < 0.05）. According to Pearson correlation analysis method， the Th17 cells and Th17/Treg were positively correlated with disease activity and IL-17， and was negatively correlated with IL-10 （P < 0.05）. The Treg cells was negatively correlated with disease activity， CRP， IL-17 and positively correlated with IL-10 （P < 0.05）. Conclusion There is a close relationship between the imbalance of Th17/Treg cells and the degree of disease activity and inflammation in the patients with UC. The balance of Th17/Treg cells in patients with UC should be ensured as much as possible in clinic， which is beneficial to the prevention and control of the disease.

[Key words] Imbalance of Th17/Treg cells; Ulcerative colitis; Disease activity; Degree of inflammation; Relationship

溃疡性结肠炎（UC）作为慢性迁延性的肠道炎性疾病，具有较高的复发性，患者的病灶大都局限在黏膜及黏膜下层区域，可累及直肠和乙状结肠，造成腹泻和黏液脓血便等症状，使患者产生较大的痛苦[1]。目前对于UC的发病机制仍未完全明确，临床认为可能和免疫、感染及遗传等诸多因素有关，其中免疫致病因素得到了较为广泛的认可[2]。有报道指出，免疫细胞和UC的病情进展有一定关系，Th17细胞可通过分泌白细胞介素（IL）-17诱导肠道内的免疫反应，而Treg细胞的减少可能与UC发病有关，但相关研究并未作深入分析[3-4]。本研究通过探讨Th17/Treg细胞失衡与UC疾病活动度以及炎症程度之间的关系，旨在为临床疾病的诊治及防控提供参考依据，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年1月～2018年5月在云南省老年病医院（以下简称“我院”）诊治的UC患者93例进行研究。纳入标准：①患者均符合《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》[5]中关于UC的诊断标准;②年龄≥18岁;③患者均对本研究知情同意，并签署了知情同意书。排除标准：①因肠道致病菌、真菌及结核分枝杆菌以及病毒等病原体引起的肠道感染者;②有其他免疫类疾病及感染性疾病者;③有血液疾病或恶性肿瘤者;④有心、肝、肾等脏器功能严重障碍者;⑤妊娠期或哺乳期妇女。93例患者中，处于活动期者56例，记为活动期组，根据改良Mayo评分划分亚组：轻度组（3～5分）19例，中度组（6～10分）24例，重度组（11～12分）13例;缓解期者37例，记为缓解期组，另选同期在我院进行健康体检的40名志愿者作为对照组。各组一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性，见表1。本研究已通过医院医学伦理委员会的审核及批准。

1.2 研究方法

1.2.1 仪器和试剂  （1）美国BD公司生产的Calibur流式细胞仪。（2）美国Thermo公司生产的酶标仪。（3）美国eBioscience公司生产的以下试剂：①抗人CD4-FITC;②CD25-APC;③Foxp3-PE;④CD3-APC;⑤CD8a-FITC;⑥IL-17A-PE抗体;⑦刺激阻断剂;⑧固定破膜液。（4）C反应蛋白（CRP）、IL-17及IL-10的ELISA试剂盒购自深圳的晶美生物工程公司（批号：20161101）。

1.2.2 Th17细胞检测  为各组受试者采集其在空腹状态下250 μL经肝素钠抗凝的全血，添加250 μL 150 g/L胎牛血清型BPMI 1640及1 μL的刺激阻断剂进行细胞重悬，置于5%CO2恒温箱内培养约4 h。再取刺激后约100 μL的抗人CD8a-FITC和CD3-APC在4℃条件下行25 min的避光孵育，依次添加MEDIUM A、B液，在室温下孵育约15 min，给予2次PBS液冲洗，再将抗人IL-17A-PE抗体在4℃条件下行25 min的避光孵育，给予PBS液冲洗后重悬待测。

1.2.3 Treg细胞檢测  为各组受试者采集其在空腹状态下100 μL经肝素钠抗凝的全血，加入标记抗人CD4-FITC及CD25-APC在4℃条件下行25 min的避光孵育，再加进红细胞裂解液，在室温下放置10 min，以PBS液冲洗2次，再加入固定破膜液于4℃下避光放置1 h，给予2次PBS液冲洗，抗人Foxp3-PE在4℃条件下避光孵育约25 min，给予2次PBS液冲洗，通过流式细胞仪和Flowjo7.6软件实施检测分析。

1.2.4 CRP、IL-10及IL-17检测  为各组受试者采集其在空腹状态下4 mL外周血，以12 cm的离心半径给予10 min、3000 r/min的离心之后提取上清液，通过酶联免疫法及相关试剂盒内的说明书描述步骤进行操作，记录酶标仪下OD450读数，并将OD值作为横坐标，标准品浓度作为纵坐标，制作标准曲线，最终记录CRP、IL-10及IL-17水平。

1.3 统计学方法

通过SPSS 21.0统计软件对数据分析，计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较选采用方差分析，两组间比较采用t检验。相关性分析采用Pearson法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Th17、Treg细胞比例比较

活动期组及缓解期组的Th17细胞比例及Th17/Treg水平较对照组高，且活动期组较缓解期组高，活动期组的Treg细胞比例较对照组低（P < 0.05）。重度组的Th17/Treg水平较轻度组和中度组高，且Th17细胞比例较轻度组高，Treg细胞比例较轻度组和中度组低（P < 0.05）。见表1。

2.2 各组CRP、IL-10及IL-17水平比较

活动期组及缓解期组的CRP及IL-17水平较对照组高，且活动期组较缓解期组高（P < 0.05）。活动期组及缓解期组的IL-10水平较对照组低（P < 0.05）。重度组的CRP及IL-17水平较轻度组高，IL-10水平较轻度组低，重度组的CRP水平较中度组高，且中度组CRP水平较轻度组高（P < 0.05）。见表2。

2.3 Th17、Treg细胞与疾病活动度及炎症程度的关系

Pearson相关性分析结果提示，Th17细胞及Th17/Treg与疾病活动度、CRP及IL-17均呈正相关，与IL-10呈负相关（P < 0.05）。Treg细胞与疾病活动度、CRP及IL-17均呈负相关，与IL-10呈正相关（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

UC属于一种慢性非特异型炎症类疾病，患者通常会出现腹痛、腹泻、黏液脓血便和里急后重等肠道症状，病灶区主要分布在大肠黏膜和黏膜下层，具有连续性及弥漫性特质，并可反复发作，对患者日常工作及生活具有较大危害[6-7]。以往此病在欧美等发达国家中的发病率较高，但近年来的临床资料数据显示，UC在我国的发病率也出现了逐渐升高的趋势[8-9]。

目前，关于UC的发病机制仍不明确，但相关报道显示其可能与机体的免疫异常等因素有关[10-11]。由于Th17细胞及Treg细胞在机体免疫功能的调节中具有重要作用，分析二者失衡与UC患者疾病活动度及炎症程度的关系十分必要。

Th17细胞属于辅助型T细胞，Treg细胞对机体内的免疫调节过程具有较为明显的调节作用，二者能较好地反映机体内的免疫功能状态。本研究显示，UC患者存在一定程度的Th17/Treg细胞失衡，这种失衡状态与疾病活动度有关，Th17细胞主要是通过原始的CD4+T细胞于IL-6及转化生长因子-β1等物质的刺激下不断分化形成的一类辅助型T细胞，其可通过强化细胞通透性、加速炎症细胞的募集和活化，进而使UC患者的机体内出现炎性变化[12-13]。Treg细胞属于一种T细胞亚群，具有免疫调节作用正常情况下，其可使得免疫系统能够耐受自身成分，并使机体处于免疫稳态。在UC患者机体中，Treg细胞可发挥免疫抑制作用，其不仅能杀伤机体中的CD4+、CD8+T细胞及抗原递呈细胞，而且可分泌出IL-10等细胞因子以及有细胞毒性的T細胞有关抗原4等物质而达到抑制免疫的作用[14-16]。同时，CRP、IL-17及IL-10均属于炎性细胞因子，三者对机体内的炎性反应具有较好的指示性作用。本研究发现，UC患者机体中的CRP、IL-17水平有升高趋势，但IL-10水平有下降趋势，且三者指标的变化与病情有较大联系。UC患者机体内炎症状态较为明显，导致CRP这一敏感的炎症指标水平不断上升。Th17细胞所分泌出的IL-17属于诱导机体内炎性反应的关键细胞因子，其可参与到炎症的形成及宿主对细菌感染的防御过程，能够引起组织浸润及损伤[17-18]。适应性调节型T细胞所分泌的IL-10可降低机体中的炎性细胞因子水平，并对由T细胞所介导的有关免疫反应发挥抑制作用。本研究进一步根据Pearson相关性分析发现，Th17细胞及Th17/Treg与疾病活动度、CRP及IL-17均呈正相关，与IL-10呈负相关（P < 0.05）。Treg细胞与疾病活动度、CRP及IL-17均呈负相关，与IL-10呈正相关（P < 0.05），提示UC患者机体中的Th17/Treg细胞失衡与其疾病活动度以及炎症程度具有明显的关联性。分析原因主要是因为Treg细胞减少能够促使CD4+T细胞朝Th17细胞不断分化，致使Th17细胞比例上升、功能亢进，强化了炎性细胞因子等分泌，最终产生炎性反应[19-20]。而Th17细胞增多后又可提升IL-17水平，但Treg细胞减少后又可降低IL-10水平，同时自身反应型T细胞逐渐被激活，而抑制性免疫细胞因子减少，此种变化又会导致肠道黏膜炎症加重。因此，无论是Th17细胞增多，或是Treg细胞减少，临床上均应确保Th17/Treg细胞平衡，可较好地预防UC发作。

综上所述，UC患者机体中Th17/Treg细胞失衡与其疾病活动度及炎症程度之间存在密切相关性，临床上应尽可能地维持患者Th17/Treg细胞平衡，从而有利于病情防控。

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（收稿日期：2018-09-25  本文编辑：金   虹）