植物来源角鲨烯的制备与检测方法研究进展

卢克刚，张红霞

（1.山东职业学院，山东济南250104；2.山东省食品药品检验研究院，山东济南250101）

角鲨烯（squalene）是由6 个异戊二烯单位构成的链状三萜化合物，含6 个全反式双键，分子式为C30H50，化学名为2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。成品角鲨烯为微黄色至无色透明油状液体，略带特有的芳香气味，易溶于乙醚、石油醚、丙酮和四氯化碳，微溶于醇和冰醋酸，不溶于水[1]。角鲨烯具有抗氧化[2]、抗辐射[3]、携氧[4]、解毒[5]、调节胆固醇代谢[6]等良好的生物活性，应用于化妆品、保健食品、医药等领域。

角鲨烯分布广泛，不仅存在于动、植物体内，在微生物体内亦有发现。深海鲨鱼肝油中角鲨烯含量一般都在40 g/100 g 以上，被认为是早期角鲨烯的主要来源[7]。动物来源的角鲨烯需要大量捕杀以鲨鱼为主的深海鱼类，随着生态保护意识的增强，使鲨鱼肝油来源的角鲨烯越来越少。利用微生物代谢调控发酵生产角鲨烯，目前产量较低，存在生产用菌株、工程菌株获得较难等诸多技术难题，还无法达到产业化水平。自1935年Thorbjarnarson T 等[8]首次在橄榄油中发现角鲨烯开始，人们逐渐重视植物来源的角鲨烯的研究与开发，研究发现苋菜籽油、罗汉果种仁油、米糠油、棕榈油等农作物种子油及植物油脱臭馏出物（deodorizer distillate，DD）中均有角鲨烯，而含量较高的橄榄油和苋菜籽油更是成为制备角鲨烯的重要工业原料[9]，因此，开发植物资源的角鲨烯，将是解决角鲨烯来源的有效途径。本文拟对近期植物来源角鲨烯制备方法和检测方法的研究进展进行综述，为角鲨烯的进一步开发应用提供参考。

1 植物来源角鲨烯的制备方法

角鲨烯的制备方法可分为两类，一类是直接从生物材料中提取、纯化，另一类是利用化学或生物技术手段合成。目前，植物来源的角鲨烯主要是直接从植物油、植物油脱臭馏出物及其他材料提取纯化而得。由于油脂价格昂贵，直接利用植物油制备角鲨烯成本较高；植物油脱臭馏出物是植物油脂精炼过程中的副产物，角鲨烯也富集于其中，因此是制备角鲨烯的理想原料，其中橄榄油脱臭馏出物中的角鲨烯已实现规模化生产；其它如罗汉果种仁、茶籽仁、苋菜种子、省沽油种子、尾巨桉木材等也发现含有一定量的角鲨烯。

由于共存成分复杂、极性相近、含量较低、综合利用等原因，一般植物来源角鲨烯的制备过程中要采用多种方法组合。常见的方法有溶剂提取、皂化、酯化、分子蒸馏、超临界萃取、柱色谱等[10]，每种方法都有其特点。几种植物来源角鲨烯制备方法[11-37]见表1。角鲨烯易溶于石油醚、三氯甲烷等溶剂，可利用索氏抽提与其他杂质分离；角鲨烯具有不可皂化性，像甘油三酯含量较高的原料可经皂化后，再用有机溶剂萃取而制得角鲨烯；游离脂肪酸、中性油含量较高的脱臭馏出物通常先用甲醇进行酯化处理，转化为脂肪酸甲酯，再结合分子蒸馏法进行分离纯化；以二氧化碳为溶剂的超临界萃取对角鲨烯有较强的提纯能力；柱色谱法有较好的选择性，一般用硅胶作为固定相，非极性的角鲨烯不易被吸附首先流出，其他极性较大的物质易被吸附而有效分离，要得到高纯度角鲨烯大多都采用了柱色谱工艺；其它利用银离子络合[35]、环糊精包合[36]等法也可以对角鲨烯进行有效分离。

表1 几种植物来源角鲨烯的制备方法Table 1 Preparation methods of squalene from several plants

2 植物来源角鲨烯的检测方法

美国官定分析化学家协会（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）标准（Revised 1996）中采用滴定法测定角鲨烯的含量[38]，该方法检测过程比较繁琐、费时费力，而且误差较大。目前，文献报道的植物来源角鲨烯的检测方法主要有气相色谱法（gas chromatography，GC）、液相色谱法（liquid chromatography，LC）和气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）。液相色谱法包括高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）和超高效液相色谱法（ultra performance liquid chromatography，UPLC）。在定量方式方面，气相色谱法和液相色谱法大多采用外标法，而内标法应用较少；气相色谱-质谱联用法则主要采用内标法定量。

在检测角鲨烯过程中，根据不同样品的特点选用适宜的预处理方法，常见的有溶剂稀释、皂化后萃取、凝胶色谱净化、固相萃取、索氏提取器抽提、甲酯化后萃取等方法。杂质干扰较少的样品可采用溶剂稀释后直接进样。对于富含脂类和色素等干扰较多的样品，则进行适当的预处理方可进行仪器分析，否则干扰物会影响色谱柱的分离效果，严重时可造成整个色谱系统的污染。粮食行业标准LST 6120-2017《粮油检验植物油中角鲨烯的测定气相色谱法》就是利用角鲨烯的不皂化性，植物油样品先经氢氧化钾-乙醇溶液皂化，再经正己烷萃取，以角鲨烷为内标测定角鲨烯的含量[39]。

2.1 气相色谱法

影响气相色谱法检测的主要因素有毛细管柱、柱温、载气流速和检测器等。由于角鲨烯具有高沸点（285 ℃）、难挥发等特点，为保证其充分气化，所以选取非极性的高温低流失毛细管柱，文献中多选HP-5毛细管色谱柱（30.0 m×0.32 mm×0.25 μm）。柱温的控制主要有恒温、程序升温两种方式，由于植物来源的样品基质较为复杂，通常采用程序升温方式，以实现角鲨烯与样品中其他组分有效分离。气相色谱法常用的氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）对碳氢化合物有较高灵敏度，角鲨烯是由碳和氢两种元素组成，文献报道中都选用FID 检测器。几种植物来源角鲨烯的气相色谱法检测方法[40-46]见表2。

表2 几种植物来源角鲨烯气相色谱检测方法Table 2 Determination of squalene in plants by GC

续表2 几种植物来源角鲨烯气相色谱检测方法Continue table 2 Determination of squalene in plants by GC

2.2 液相色谱法

色谱柱、流动相体系、洗脱模式和检测器的选择是影响液相色谱法的主要因素。由于角鲨烯是非极性化合物，故以表面键合极性相对较弱的十八碳烷烃的反相C18柱比较适合角鲨烯的测定，而一般不选择正相色谱柱。根据样品中各化合物的极性大小差异，植物来源角鲨烯检测时使用的流动相体系主要有一元、二元体系，并且以二元体系为主。一元溶剂体系主要是甲醇，二元溶剂体系主要有甲醇/乙腈、乙腈/叔丁基甲醚、乙腈/四氢呋喃等组合。预处理后样品组分相对简单，在洗脱模式方面多采用等度洗脱，而少数比较复杂的样品则采用梯度洗脱。由于角鲨烯在紫外光区有吸收峰，目前检测器绝大多数选择的是紫外检测器和二极管阵列检测器，波长范围大多在203 nm～210 nm之间。几种植物来源角鲨烯的高效液相色谱法检测方法[47-56]见表3。

表3 几种植物来源角鲨烯高效液相色谱检测方法Table 3 Determination of squalene in plants by HPLC

续表3 几种植物来源角鲨烯高效液相色谱检测方法Continue table 3 Determination of squalene in plants by HPLC

由于超高效液相色谱（UPLC）使用的填料粒径更小、死体积更小、工作压力更高、线性速度更快，所以在灵敏度和分析速度等方面比HPLC 都有很大提高。陈伟珠等[57]使用超高压液相色谱仪配TUV 检测器，以甲醇-水（95∶5，体积比）、流速0.4 mL/min、波长210 nm的条件下进行检测，角鲨烯在0.2 μg/mL～10 μg/mL 范围内浓度和面积呈现良好的线性关系，检测限为0.1 ng，平均回收率为100.82%，样品的保留时间缩短，节约溶剂，提高了检测效率。

2.3 气相色谱-质谱联用法

与气相色谱法、液相色谱法相比，气相色谱-质谱联用法具有较高的灵敏度和选择性。该法中气相色谱条件的选择与气相色谱法一致，多采用弱极性HP-5MS 毛细管柱和程序升温方式。气相色谱-质谱联用法最常用的离子化方式是电子轰击离子化（EI）和化学离子化（CI）。EI 源适合绝大多数化合物的检测；而CI源对高亲电化合物的灵敏度高、选择性强，对某些带有强电负性（如含有Cl、F、O、Br 等）的化合物检测时具有独特的优越性。角鲨烯不具有电负性，所以测定角鲨烯最常用的是EI 源。质谱质量分析器有四极杆和离子阱，其扫描模式主要采用选择离子扫描（SIM）和全扫描（Scan）两种，其中SIM 扫描选定离子结构信息，常用于微量或痕量组分的定量分析，而Scan 扫描所有未知物结构信息，测量较为全面，主要用于组分的定性分析。几种植物来源角鲨烯气相色谱-质谱联用法检测方法[58-65]见表4。

表4 几种植物来源角鲨烯气相色谱-质谱检测方法Table 4 Determination of squalene in plants by GC-MS

续表4 几种植物来源角鲨烯气相色谱-质谱检测方法Continue table 4 Determination of squalene in plants by GC-MS

3 结语

角鲨烯具有多种生物活性，应用于多个不同领域。因其能够抗氧化、抗紫外线、保湿、营养肌肤而在化妆品中用作润肤剂、保湿剂[9]，还可作为功能性食品添加剂、药物缓释剂、食品机械设备的润滑剂、衣物护理剂等使用[1]。随着人们对角鲨烯认识的不断深入，对其需求会不断加大。以上综述可见角鲨烯的植物来源比较广泛，相比较动物来源和微生物发酵更具有可持续性，会成为解决角鲨烯来源的一条重要途径。但由于角鲨烯在大多数植物体中含量较低，导致单一提取制备成本较高，应探索综合开发利用。因此，在角鲨烯的研究开发过程中，要不断优化制备工艺，多采用先进提取分离技术，降低能耗，减少有毒有害溶剂的使用，开发出更加高效、环保、可行的方法。目前的检测方法对前处理要求高、过程复杂，所用大型仪器价格昂贵，不能大量普及。因而应研究开发更高效、稳定、便捷的基质前处理方法，实现复杂基质有效净化，提高检测效率。