博落回中绿霉病抑菌物质的提取工艺及抑菌稳定性研究

丁仁惠，何小娥，王文龙，石浩，2，*

（1.湖南应用技术学院农林科技学院，湖南常德415100；2.湖南农业大学园艺园林学院，湖南长沙410128）

柑橘是我国南方重要的水果之一，具有丰富的营养价值，含有大量的VC、有机酸、矿物质、黄酮类、柠檬苦素等物质[1-2]。但柑桔果实在贮藏期间因烂果造成的损失每年在15%～30%，严重时可达以40%上，大量鲜桔因无法及时处理而霉烂，造成巨大的经济损失。柑橘侵染性病害以真菌性病害侵染最为严重，常见的真菌为绿霉属（Penicilium digitatum）、青霉属（Penicilium italicum）、炭疽杆菌（Colletotrichum gloeosporiorides Penz）等[3-4]，近年来研究发现，我国柑橘采后腐烂约80%是由绿霉（指状青霉，P.digitatum）引起[5]。柑橘鲜果腐败严重，藏期太短，货架期不长，这些问题不仅造成了巨大的经济损失，还威胁到了消费者的健康，因此必须找到高效安全的解决办法。通过采后对柑橘进行及时的药剂处理可以较大程度地延长保鲜期限，是保证柑橘大规模贮藏能够成功的最主要前提之一[6]。由于植物源杀菌剂有着高效低毒，低残留，对环境影响小，不易产生抗药性等优点，因此，开发植物源杀菌剂不仅可以有效地控制植物病害，而且能缓解大量化学合成农药带来的环境压力[7-9]。博落回（Macleaya cordata（Willd.）R.Br.）是粟科，博落回属多年生直立草本植物，在我国南方地区分布及种植较为广泛[10]。博落回中主要次生代谢物质有生物碱类、酚类、酯类、醌类、酮类、皂素类、挥发油类等，博落回具有杀菌、散瘀、祛风、解毒、止痛、杀虫的功效[11-12]。关于博落回在柑橘采后病害抑菌方面已有相关的研究，但抑菌提取物多为溶剂粗提物，抑菌效果不是很好，且容易造成植物及提取溶剂的大量浪费，总体抑菌效率低[13-14]。试验以博落回提取物对指状青霉抑菌效果为指标，探讨博落回提取物的最佳提取工艺，同时对提取物进行抑菌稳定性研究，以期得到提取物的最佳抑菌效果，提高抑菌效率，进而为博落回抑菌提取物的工业化生产及柑橘的大规模高效商业化绿色保藏提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

指状青霉：实验室（国家柑橘中心长沙分中心）自行分离鉴定所得；博落回：国家中药材生产（湖南）技术中心；葡萄糖、琼脂粉、吐温、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、盐酸、氢氧化钠，氯化镁、石油醚、氯化铜、氯化铁、氯化钠、硝酸银（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；有机试剂均为分析纯。

THZ-92B 可调速控温摇床：上海浦东物理仪器厂；SB-3200D 超声波仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；DR-1001 旋转蒸发仪：郑州长城科工贸有限公司；ZW1105051705 紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；G16 台式高速离心机：长沙英泰仪器有限责任公司；灭菌锅HVA-85 全自动高压蒸汽灭菌锅：天津永大化学试剂有限公司；PHS-25 酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；DHG-9246A 电热恒温干燥箱：上海精宏试验设备有限公司；DSZ2000X 倒置生物显微镜：北京中显恒业仪器仪表有限公司；DK-98-IIA电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 植物提取液的制备

精确称取博落回植物样品粉末50 g 于1 L 洁净烧杯中，加入1 L 提取溶剂，将烧杯放入超声仪中，在60 ℃温度下经500 W 超声波提取2.0 h，然后将提取液进行抽滤，滤液经浓缩至浸膏状，丙酮溶解，倒入50 mL 容量瓶中定容。配成活性物质提取物，质量浓度1.0 g/mL，以上重复3 次，对提取物母液进行编号，置于4 ℃冰箱中，保存备用。

1.2.2 菌液的制备

指状青霉菌种经活化后接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar medium，PDA）试管斜面培养，28 ℃避光培养3 d，用加有吐温的无菌生理盐水约4 mL 冲洗，搅拌打散、离心、放入离心管过滤菌丝。采用比浊法测定菌悬液浓度，菌液浓度控制在106cfu/mL～107cfu/mL 之间，4 ℃贮藏备用。

1.2.3 提取液抑菌活性的测定

先倒入约12 mL 底层培养基，待其凝固后，将35 ℃左右已融化的培养基9 mL 与1 mL 菌悬液混合、充分摇匀，控制菌液浓度在105cfu/mL～106cfu/mL 之间，并倒于平板内。待上层培养基快凝固时，取经灭菌的牛津杯置于上层培养基内，每个培养皿放置4 个牛津杯，各杯中加入100 μL 博落回提取液（经0.22 μm有机滤膜过滤除菌），将培养皿用封口膜封口后放置于28 ℃的恒温培养箱中避光培养，每个处理做3 个重复，培养72 h 后用游标卡尺测量抑菌圈直径（十字交叉法）。

1.2.4 抑菌活性物质的单因素提取工艺

以菌体抑制直径作为参考指标。改变其中的某一个单因素条件，其它条件同1.2.1，每次单因素取1 g 植物粉末样品进行超声提取，评价各因素条件下的提取物对指状青霉抑制效果的影响。单因素试验因素水平见表1。

表1 单因素试验因素水平Table 1 Single factor experimental factors and levels

1.2.5 响应曲面试验设计

其采用更为合理的试验设计，能够快速有效的确定多因素水平的最优试验条件[15]。在单因素试验的基础上分别选择料液比（g/mL）、提取温度（℃）、提取时间（h）、超声功率（W）4 个主要因素分别选择3 个水平，以菌抑制直径（Y）为考察指标，进行进行Box-Behnken试验设计，优化博落回中抑菌物质提取工艺的条件。

因素水平表见表2。

表2 Box-Behnken响应曲面设计试验因素水平和编码Table 2 Response surface experimental design of Box-Behnken of factor levels and code

1.2.6 提取液抑菌性质的测定

1.2.6.1 光及紫外光照射对提取液抑菌活性的影响

将1.2.1 中提取物取0.5 mL 6 份，分别置于6 支透明的玻璃试管中编号，分别在15 W、相距40 cm 的日光灯以及紫外灯下照射5、7、12、24、36、48 h。参照上述方法，每个牛津杯中放入100 μL 提取物溶液，置于28 ℃的培养箱中培养72 h，每组测定3 次平行。用游标卡尺量取抑菌圈上下、左右的直径，取平均值确定抑菌效果。

1.2.6.2 温度对提取液抑菌活性的影响

将提取物分成6 份，分别放在玻璃试管中编号，同时分别放置于-20、4、20 ℃条件下处理3 d，70、80、100 ℃水浴条件下处理8 h，用杯碟法测定抑菌效果，平行测定3 次。

1.2.6.3 pH 值对提取液抑菌活性的影响

将提取物分成6 份，用氧氧化钠和盐酸调节pH值，分别配置3、4、6、7、8、12 的抑菌液。平衡24 h 后，用杯碟法测定抑菌效果，平行测定3 次。

1.2.6.4 提取液贮藏性能的影响

提取物分别在4 ℃和20 ℃下保存，每隔20 d 测定一次抑菌活性，供测6 次，以指状青霉作为指示菌测定抑菌效果。用杯碟法测定抑菌效果，平行测定3 次。以了解博落回提取液在不同温度下的贮藏性能。

1.2.6.5 金属离子对提取物抑菌活性的影响

将提取物水溶液分成6 份，在提取液中分别加入其最终浓度为10、50、100、150、180、200 mmol/L 的氯化钠、氯化镁、氯化铁、氯化铜和硝酸银。用杯碟法测定各溶液对菌的抑菌效果，平行测定3 次。

1.2.7 数据分析及图形制作

采用WPS 软件进行数据处理及图形的制作。采用SPSS18.0 软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素提取工艺

2.1.1 提取溶剂对提取液抑菌活性的影响

不同提取溶剂对抑菌活性的影响见图1。

图1 不同提取溶剂对抑菌活性的影响Fig.1 Effect of different extraction solvents on antibacterial activity

博落回不同溶剂提取物的抑菌效果具有较大的差别，如图1可知，水提物、氯仿提取物、石油醚提取物的抑菌圈直径都较小，均低于15 mm，其中石油醚提取物组抑菌圈直径仅为9.63 mm；而乙醇、丙酮、乙酸乙酯提取物的抑菌圈直径均都比较大，均在20 mm 以上，尤其是乙醇提取物组的抑菌圈直径达到了24.46 mm。其中不难看出，极性过大的水和极性较小的氯仿、石油醚提取物抑菌能力较小，可能是因为3 种提取物本身抑菌能力很弱，或者是有效物的提取量较少所致[16]；另外3 组提取物抑菌效果较好，尤其是乙醇提取物组，同时乙醇无毒、便于回收，因此选择乙醇作为博落回抑菌物质的提取溶剂。

2.1.2 溶剂浓度对提取液抑菌活性的影响

不同溶剂浓度对抑菌活性的影响见图2。

图2 乙醇浓度对抑菌活性的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on antimicrobial activity

博落回不同乙醇浓度提取物的抑菌效果具有较大的差别，由图2可知，在乙醇浓度为20%时，抑菌圈直径仅为15.22 mm，随着提取液乙醇浓度的增加，抑菌圈直径呈现增大趋势，乙醇浓度为80%时，抑菌圈直径达到了24.19 mm（P＜0.05），说明较高浓度乙醇作为提取溶剂时，提取物具有较强的抑菌活性，可能此时抑菌有效物质和80%乙醇极性相似[17]；当乙醇浓度超过80%以后，抑菌效果趋于平缓，出于节约试验成本的考虑，选择80%的乙醇作为抑菌物质的提取溶剂，抑菌效果较佳。

2.1.3 溶剂倍数对提取液抑菌活性的影响

不同料液比对博落回提取物抑菌效果的影响见图3。

图3 溶剂倍数对抑菌活性的影响Fig.3 Effect of solvent multiple on antimicrobial activity

如图3所示，采用80%的乙醇作为提取溶剂，随着提取溶剂倍数的增加，提取物抑菌效果有所增强，当提取料液比为1∶15（g/mL）时，抑菌圈直径仅为16.17 mm，说明有效物的提取量较低，当提取物料液比为1∶30（g/mL），抑菌圈直径增加了40.30%，但随着溶剂倍数的继续增加，抑菌效果增加不明显，不具有显著性差异（P＞0.05），可能此时抑菌有效物基本上以完全溶出，因此选择30 倍的提取溶剂较为合适。

2.1.4 提取温度对提取液抑菌活性旳影响

不同提取温度对抑菌活性的影响见图4。

图4 提取温度对抑菌活性的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on antimicrobial activity

不同温度下博落回提物的抑菌效果同样具有一定的差异，如图4可知，提取温度为20 ℃时，提取物的溶出量较低，抑菌效果较差，此时抑菌圈直径仅为14.03 mm，随着提取温度的增加，抑菌物质的溶出量逐渐增加，抑菌圈直径逐渐增大，抑菌效果增强。当提取温度达到70 ℃时，抑菌效果效果得到了显著的提高（P＜0.05），相对于20 ℃时，抑菌圈直径提高了67.07%。但当提取温度达到100 ℃时，提取物抑菌直径有所减小，可能是因为过高的提取温度不利于提取物的抑菌活性[18]。

2.1.5 提取时间对提取液抑菌活性的影响

不同提取时间对博落回提取物抑菌效果的影响见图5。

由图5可知，随着提取时间的增加，提取物溶出量逐渐增加，抑菌活性逐渐增强，提取时间为1h 时，抑菌圈直径为17.57 mm，说明超声提取效率较高，当提取时间达到2.5 h 时，抑菌圈直径达到了22.70 mm，随后随着提取时间的继续增加，抑菌圈直径大小改变较小（P＞0.05），说明超声提取2.5 h 时，抑菌有效物的溶出量以接近最大值[19]，因此可选取2.5 h 左右作为较适宜的超声提取时间。

2.1.6 超声功率对提取液抑菌活性的影响

不同超声提取功率对博落回提取物抑菌效果的影响见图6。

图5 提取时间对抑菌活性的影响Fig.5 Effect of extraction time on antimicrobial activity

图6 超声功率对抑菌活性的影响Fig.6 Effect of ultrasonic power on antimicrobial activity

由图6可知，超声功率在300 W 时，提取物溶出量较低，抑菌圈直径为15.89 mm，当超声功率达到700 W时，抑菌有效物质溶出量得到较大的提高（P＜0.05），此时抑菌圈直径相对于300 W 超声时提高了45.56%，说明较大的提取功率可使植物有效成分的快速溶出[20]，增大提取物的抑菌效果，随着超声功率的继续加强，提取物抑菌效果有略微的提高，但不明显，因此选取700 W 左右的超声功率较为合适。

2.2 响应面工艺回归模型的建立及方差分析

在原有单因素试验的基础上，依据Box-Behnken中心组合试验设计进行了29 组试验，其中5 组中心点重复试验，试验结果见表3，回归模型的方差分析见表4。

由软件design expert 8.0 对试验数据进行多元回归拟合分析，得到试验条件与抑菌圈直径之间的二次多项式方程为：Y=28.18+0.65A+3.74B+0.90C+1.58D+1.50AB+0.05AC-0.60AD+0.05BC+0.22BD+3.80CD-0.74A2-1.87B2-0.39C2-3.67D2。从F 值可知单因素的影响顺序为B＞D＞C＞A，即提取温度＞超声功率＞超声时间＞料液比。方差分析结果显示，AC、BC、BD显著，CD极显著，这表明他们之间对菌抑制具有明显的交叉作用，B2显著（P＜0.05），D2极显著（P＜0.01）。其中模型决定系数R2值为0.962，说明该模型能够解释96.2%响应值的变化。

表3 响应曲面试验设计及结果Table 3 Design and result of response surface test

表4 试验结果回归模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model of experimental results

续表4 试验结果回归模型的方差分析Continue table 4 Variance analysis of regression model of experimental results

图7 液料比、提取温度、超声时间和超声功率对菌抑制影响的响应面图Fig.7 The corresponding surface of liquid-solid ratio，extraction temperature，ultrasonic time and ultrasonic power to Inhibitory bacteria

2.1.3 验证试验

由软件计算得到提取物的最佳工艺条件为：提取温度72.50 ℃、超声时间2.50 h、超声功率850 W、料液比1∶27.50（g/mL），此条件下（其它条件同1.2.1）菌抑制直径的理论值为29.98 mm。实际测得试验结菌抑制直径为30.02 mm（SD=0.04），与理论预测值相比，其相对误差仅为0.04，而且重复性也很好，说明该模型可以较好地预测抑菌圈直径大小与各试验条件之间的关系，具有一定的实用价值。

2.2 抑菌活性物质的稳定性研究

2.2.1 光照对提取液抑菌活性的影响

提取物分别采用紫外光和日照光处理不同的时间后抑菌效果如图8所示。

图8 光照时间对提取物活性的影响Fig.8 Effect of light time on the activity of extracts

由图8可知，日照光照处理36 h 内抑菌活性几乎没有变化，处理48 h 后抑菌活性有略微的降低；提取物在紫外光处理24 h 后，抑菌活性开始略微的降低，在处理48 h，抑菌活性减小较为明显（P＜0.05）。说明两种光对提取物的抑菌稳定性均具有一定的影响，且紫外光影响效果更强，可能是因为紫外光可破坏有效物质的结构，从而影响其活性[21]。因此，当提取物需要长时间用于抑菌试验时最好进行避光保藏。

2.3.2 温度对提取液抑菌活性的影响

提取物不同温度处理后抑菌效果如图9所示。

图9 温度对提取物活性的影响Fig.9 Effect of temperature on the activity of extracts

由图9可知，在20 ℃内处理3 d 以及在80 ℃内处理8 h 时抑菌圈直径几乎没有减小（P＞0.05），抑菌圈直径均在24 mm 以上，当采用100 ℃处理8 h 后，提取物的抑菌能力明显的减弱，说明高温可以影响提取物的活性，这可能是因为高温破坏了提取物的结构所致[22]，因此在对博落回进行抑菌有效物质提取时，提取温度尽量不能太高，且最好得低于100 ℃。

2.3.3 pH 值对提取液抑菌活性的影响

提取物进行不同条件下的pH 值处理后抑菌效果如图10所示。

图10 pH值对提取物活性的影响Fig.10 Effect of pH value on the activity of extracts

由图10可知，当提取物pH 值处于中性或弱碱性的条件下抑菌活性最强，在弱酸性（pH 4～7）条件下抑菌活性有略微的减少（P＞0.05），当pH 值为4 时，只减少了7.55%。在碱性条件下，提取物抑菌活性的减小较为明显（P＜0.05），当pH 值为12 时，减少了26.84%，可能是较强碱性环境破坏抑菌物质结构所致[23]。因此，在进行抑菌试验时，抑菌处理环境的pH 值最好处于中性或弱减性条件下进行。

2.3.4 提取液贮藏时间对其抑菌活性的影响

提取物分别在4、20 ℃条件下处理20 d～120 d，其抑菌效果如图11所示。

图11 贮藏时间对提取物活性的影响Fig.11 Effect of storage time on the activity of extracts

由图11可知，提取物在4 ℃贮藏80 d 内抑菌活性几乎没有减小，处理100 d 后开始略微的减小，处理120 d 后有一定的减小（P＜0.05）。提取物在20 ℃贮藏80 d 时抑菌活性开始缓慢减小，在贮藏100 d 以后提取物的抑菌活性降低明显，且具有显著性差异（P＜0.05），在贮藏120 d 后，抑菌圈直径减小了19.01%。因此，提取物在4 ℃条件下贮藏最好不要超过100 d，20 ℃条件下贮藏最好不要超过80 d。

2.3.5 阳离子对提取液抑菌活性的影响

提取物不同金属离子处理后抑菌效果如图12所示。

图12 金属离子对提取物活性的影响Fig.12 Effect of metal ion on the activity of extracts

由图12可知，随着金属离子浓度的增加，提取物抑菌活性均有一定量的减少，但不同离子间差别较大。Na+、Mg2+在200 mmol/L 范围内对提取物抑菌影响效果不大（P＞0.05），Cu2+、Fe3+对提取物的影响相对较大，在浓度为150 mmol/L 时抑菌活性便有一定量的减少，Ag+相对于前4 种离子抑菌活性减小量最为明显，浓度为100 mmol/L 时抑菌活性便有一定量的减少，200 mmol/L 时抑菌圈直径相对于10 mmol/L 时减小了20.24%。可能是重金属盐具有过大的氧化性，或者易与提取物结合成络合物，从而降低活性[24]。可知，活泼金属盐影响抑菌活性较小，重金属盐影响较大，尽量避免重金属污染。

3 结论

试验以柑橘绿霉病原菌（指状青霉菌）抑菌圈为指标，对博落回抑菌物质提取工艺及提取物抑菌稳定性研究。得到单因素的影响顺序为提取温度＞超声功率＞超声时间＞料液比，最佳提取工艺条件为提取温度72.50 ℃、超声时间2.50 h、超声功率850 W、料液比1∶27.5（g/mL），此条件下菌抑制直径的理论值为29.98 mm。实际测得试验结菌抑制直径为30.02 mm（SD=0.04），与理论预测值相比，其相对误差仅为0.04%，且重复性也很好。当提取物需要长时间用于抑菌试验时最好进行避光保藏，提取物提取温度尽量不能太高，且最好得低于100 ℃，提取物抑菌处理环境的pH值最好处于中性或弱减性条件下进行，提取物在4 ℃条件下贮藏最好不要超过100 d，20 ℃条件下贮藏最好不要超过80 d，活泼金属盐影响提取物抑菌活性较小，重金属盐影响较大，提取物尽量避免重金属盐污染。博落回提取物作为一种柑橘果实的新型植物源保鲜剂，具有高效、绿色、环保贮藏的特点、具有一定实际生产意义。试验中博落回提取物属于80%乙醇提取的一种粗提物，纯度不是很高，不能确定其主要物质结构，在后期的研究过程中，可有待对提取物进一步纯化，确定结构，探讨其抑菌机理。