过敏性紫癜患者CD4+T细胞叉头框蛋白3基因甲基化水平及其与调节性T细胞的关系

树叶 罗鸯鸯 罗勇奇 汤建萍 肖嵘

1湖南省儿童医院皮肤科，长沙 410007；2中南大学湘雅二医院皮肤科，长沙 410008

过敏性紫癜的病因复杂，常在特定的遗传易感性基础上，由感染和过敏等环境因素诱发，但具体的发病机制仍不清楚。CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）作为具有免疫抑制功能的T细胞，可以防止机体免疫系统过度活化，维持免疫平衡状态，避免机体出现一系列自身免疫疾病。多项研究发现，某些自身免疫性疾病伴随出现CD4+CD25+Treg数量下降和/或功能损伤［1-3］。叉头框蛋白3（forkhead box protein 3，Foxp3）主要表达于Treg，对该细胞的发育、分化成熟、维持免疫抑制功能起关键作用，被公认为CD4+CD25+Treg的标志［4-5］。Foxp3基因对维持免疫平衡有重要作用，其移码突变可造成编码蛋白scurfin缺陷，进一步造成小鼠致死性淋巴细胞增殖性疾病［5］。影响Foxp3基因表达的原因很多，近年研究表明，表观遗传学甲基化状态对人Treg的Foxp3基因具有重要的调控作用［6-7］。我们检测过敏性紫癜患者CD4+CD25+Treg比例和Foxp3基因mRNA及启动子区甲基化水平，探讨甲基化调控Foxp3基因在过敏性紫癜发病机制中的作用。

对象与方法

一、一般资料

2015年3月至2016年10月在中南大学湘雅二医院皮肤科收集20例过敏性紫癜住院患者和20例健康体检者。20例患者均符合过敏性紫癜国际诊断标准（下肢出现紫癜或瘀点，血小板数目正常，合并以下任意1项：腹痛、关节炎或关节肿痛、肾脏受累、组织病理示IgA血管炎）［8］，排除其他原因所致的血管炎和紫癜，无其他免疫系统疾病、无糖皮质激素或免疫抑制剂治疗史。所有病例均有皮肤紫癜症状，其中12例伴关节肿痛，6例合并腹痛及粪便隐血，11例合并肾脏损害（出现蛋白尿和/或尿红细胞计数阳性），部分患者同时出现关节、消化道和肾脏损害，参照文献［9］进行临床评估，评分为4.7±1.65。患者组男女比例13∶7，年龄（26.15±18.13）岁。健康对照组中男女比例12∶8，年龄（28.56±17.45）岁，无过敏性疾病或免疫性疾病史。两组间性别、年龄差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经湖南省儿童医院医学伦理委员会批准（批件号：HCHLL-2016-006），患者均签署知情同意书。

二、外周血单个核细胞（PBMC）及CD4+T细胞的分离

采集受试者外周静脉血60 ml，肝素抗凝，采用人淋巴细胞分离液（瑞典GE Healthcare公司）通过密度梯度离心法分离PBMC。采用人CD4+T细胞阳性磁珠分选试剂盒（德国Miltenyi公司）分选CD4+T细胞亚群。

三、流式细胞仪分析CD4+CD25+Treg比例

参考流式细胞仪检测说明书，将分离的CD4+T细胞首先进行细胞膜CD4-FITC、CD25-PerCP单克隆抗体双标记，破膜固定后进行FoxP3-PE单克隆抗体胞内染色。CD4-FITC、CD25-PerCP、Foxp3-PE单克隆抗体均为美国BD公司产品。应用流式细胞仪（美国BD公司）和CellQuest software软件分析CD4+CD25+Treg的比例。

四、荧光实时定量PCR分析CD4+T细胞中Foxp3 mRNA水平

参照说明书，采用Trizol RNA提取试剂（美国Life Science公司）提取CD4+T细胞亚群的总RNA，应用紫外分光光度仪测定RNA纯度。采用PrimeScriptTMRT试剂盒（日本TaKaRa公司）按照说明书合成cDNA第一链。采用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒（日本TaKaRa公司），以cDNA为模板，配制RT-PCR反应体系：上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，无酶水7.2 μl，2×SYBR Premix Ex Taq realtime PCR mix 10 μl，cDNA 2 μl，总体积20 μl。Foxp3正向引物5′-CAAGTTCCACAACATGCGAC-3′，反向引物5′-ATTGAGTGTCCGCTGCTTCT-3′；以β肌动蛋白作为内参照，正向引物5′-GCACCACAC CTTCTACAATGAGC-3′，反向引物5′-GGATAGCAC AGCCTGGATAGCAAC-3′。由上海铂尚基因生物公司合成引物。应用Rotor-Gene 3000实时PCR仪（澳大利亚Corbett Research公司）扩增，反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火延伸20 s，45个循环。采用2-ΔΔCt表示靶基因的相对表达量，患者组ΔCt=患者样品Ct值均值-内参Ct值，对照组ΔCt=对照样品Ct值均值-内参Ct值，ΔΔCt=患者组ΔCt-对照组ΔCt。

五、Foxp3启动子甲基化片段扩增与测序

参照说明书，使用基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取CD4+T细胞总DNA。使用EpiTect®Bisulfite试剂盒（德国Qiagen公司）对总DNA进行亚硫酸盐转化。使用甲基化特异性PCR试剂盒（北京天根生化科技有限公司）扩增Foxp3启动子甲基化片段。参考UCSC Genome Browser上人Foxp3基因的DNA序列，采用软件MethPrimer设计甲基化引物，正向引物5′-TATA ATTAAGAAAAGGAGAAATATAGAGAG-3′，反向引物5′-TCAACCTAACTTATAAAAAACTATCAC-3′。

将扩增产物和载体pGEM-T easy vector（美国Promega公司）连接，然后转化DH5α大肠杆菌感受态细胞（北京天根生化科技有限公司），在氨苄西林（+）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（+）异丙基硫代半乳糖苷（+）LB平板上培养。根据蓝白挑选原则，选择10个阳性克隆，送至深圳华大基因公司测序。每例受试者选择10个克隆，根据测序结果，分析CG位点的变化，进而计算甲基化水平。若CG位点全部保持不变，则甲基化水平为1，若全部变化，则为0。

六、统计学分析

使用SPSS16.0软件分析数据。计量资料以±s表示。采用独立样本t检验比较样本均数，单因素直线相关分析评估指标的相关性，计算Pearson相关系数。P＜0.05认为差异有统计学意义。

结果

一、患者及健康对照组外周血CD4+CD25+Treg比例

见图1、表1。与健康对照组相比，过敏性紫癜患者外周血Treg在CD4+T细胞中的百分比显著降低（P＜0.05）。

二、患者及健康对照组CD4+T细胞中Foxp3基因mRNA表达水平及Foxp3基因启动子区甲基化水平

与健康对照组相比，患者组外周血CD4+T细胞Foxp3 mRNA的表达水平显著降低（P＜0.01），见表1。

亚硫酸氢钠测序结果显示，患者组外周血CD4+T细胞Foxp3基因启动子区8个CG位点的总甲基化水平较健康对照组显著升高（P＜0.01）（表1）。患者平均甲基化水平也较健康对照组显著升高（t=3.610，P＜0.01）。见图2。

三、患者CD4+T细胞Foxp3基因启动子区域甲基化水平与临床病情评分和肾损害的相关性

图1 流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg在CD4+T细胞中的比例与健康对照组相比，过敏性紫癜组CD4+CD25+Treg在CD4+T细胞中的比例显著降低

表1 过敏性紫癜患者外周血CD4+T细胞中CD4+CD25+Treg比例以及Foxp3 mRNA和基因启动子区总甲基化水平（±s）

表1 过敏性紫癜患者外周血CD4+T细胞中CD4+CD25+Treg比例以及Foxp3 mRNA和基因启动子区总甲基化水平（±s）

组别患者组健康对照t值P值例数20 20 Treg比例（%）1.668±0.959 2.741±1.131 2.552＜0.05 Foxp3 mRNA（2ΔΔCt）0.380±0.226 1 9.503＜0.01 Foxp3启动子区甲基化水平0.712±0.164 0.453±0.147 3.610＜0.01

图2 过敏性紫癜（HSP）患者及健康对照组CD4+T细胞Foxp3基因启动子8个CG位点平均甲基化水平HSP患者（20例）各CG位点的平均甲基化水平较健康对照组（20例）明显升高

患者外周血CD4+T细胞Foxp3启动子区总甲基化水平与CD4+CD25+Treg比例呈显著负相关（r=-0.490，P＜0.05），但与临床病情评分呈显著正相关（r＝0.486，P＜0.05），见图3、4。肾损害组（11例）CD4+T细胞Foxp3启动子区总甲基化水平（0.749±0.095）显著高于无肾损害组（9例，0.643±0.075），P＜0.05。

讨论

DNA甲基化主要在转录水平调控基因表达，并且DNA甲基化的信息可随DNA的复制而遗传，是表观遗传学最重要、最经典、研究最深入的内容之一。CpG岛位于基因的启动子、增强子或其他区域，是基因转录的起始区。DNA甲基化主要发生在5′-CpG-3′的C上，生成5-甲基胞嘧啶，甲基通过阻碍蛋白质与DNA结合降低基因转录，下调基因表达。近年研究发现，多种自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（SLE）、硬皮病、干燥综合征中，多种基因受到DNA甲基化的调控而过表达或低表达，在不同程度上影响了疾病的发生、进展和预后［10-12］。环境诱发因素如细菌、病毒、特定过敏原、日光、硅、疫苗或者药物可以通过DNA甲基化途径，影响某些基因的表达，在一定程度上参与发病。

图3 20例过敏性紫癜患者Foxp3基因启动子区甲基化水平与CD4+CD25+Treg百分比呈显著负相关

图4 20例过敏性紫癜患者Foxp3基因启动子区甲基化水平与病情评分呈显著正相关

CD4+CD25+Treg是具有免疫抑制调节功能的成熟T细胞亚群，其数量下降和/或功能降低有可能破坏机体固有的免疫平衡，引起自身免疫性疾病。Tselios等［13］发现，CD4+CD25+Treg的数量和SLE的疾病活动程度呈明显负相关，其改变可灵敏地反映SLEDAI的变化，故可以作为一种评价SLE疾病活动度的生物标记。活动性类风湿性关节炎患者外周血CD4+CD25+Treg数量降低，并且与类风湿性关节炎病情活动性评分、C反应蛋白及红细胞沉降率呈负相关［14］。流式细胞仪检测发现，进行期银屑病患者外周血中CD4+CD25+Treg数量较健康人明显下降，治疗后和疾病缓解期Treg数量上升［15］。Antiga等［16］用流式细胞仪、酶联免疫吸附实验和免疫组化方法发现，在系统性硬化和硬斑病患者的皮损和外周血中，CD4+CD25+Treg比例和白细胞介素10、转化生长因子β的表达均比健康人减少。

我们检测发现，过敏性紫癜组较健康对照组外周血CD4+T细胞中Foxp3基因表达降低，CD4+CD25+Treg百分比下降。推测Treg数量下降导致免疫抑制功能降低，破坏患者的免疫自稳状态，诱发过度免疫反应，这可能是过敏性紫癜的发病机制之一。进一步比较发现，患者组较健康对照组CD4+T细胞中Foxp3启动子区甲基化水平明显升高。上述结果证实，患者Foxp3基因和Treg的表达下降受到DNA甲基化的调控［6-7］。最后，我们分析探讨Foxp3启动子区甲基化水平的相关因素，发现患者外周血CD4+T细胞Foxp3启动子区甲基化水平与CD4+CD25+Treg比例呈显著负相关，但与临床病情评分呈显著正相关，且肾损害组CD4+T细胞Foxp3启动子区甲基化水平明显升高。提示过敏性紫癜患者CD4+T细胞Foxp3基因启动子区高甲基化，抑制Foxp3基因，进一步影响Treg的产生，这可能是过敏性紫癜免疫紊乱的发病机制之一，需要进一步深入研究。