新型含铁聚合物纳米气泡超声造影剂的制备及其声学特性

2019-04-28李佳萍江燕王豆豆余方芳程跃跃刘哲

温州医科大学学报 2019年4期

李佳萍，江燕，王豆豆，余方芳，程跃跃，刘哲

（1.温州医科大学眼视光学院生物医学工程学院，浙江温州 325027；2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院超声影像科，浙江温州 325027）

纳米级超声造影剂具有体积小，可以自由通过血管内皮，在血液循环中稳定性强[1]，较强的高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR）的独特优点，这为纳米泡靶向诊断和治疗血管外病变组织的应用提供了理论依据[2-3]。磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和超声成像（ultrasond，US）由于分别具有较高的空间分辨率和较好的实时成像能力，被认为是2种互补的成像技术[4]。在本研究中，我们利用聚氰基丙烯酸丁酯（poly butyl cyanoacrylate，PBCA）乳化聚合物和超顺磁性氧化铁（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）纳米粒子为原料，开发了聚合物纳米气泡，并研究了其在超声下的信号强度。

1 材料和仪器

1.1 材料氰基丙烯酸丁酯（butyl cyanoacrylate，BCA）购于德国Sichel Werke公司，三氯化铁（FeCl3）、四水氯化铁（FeCl2·4H2O）、Triton X-100和聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidon，PVP）购于美国Sigma-Aldrich公司，明胶购自德国Merck公司，氢氧化铵溶液（ammonium hydroxide solution，NH3·H2O，25%）购于北京百灵威公司。

1.2 仪器 Heraeus Multifuge离心机（美国Thermo Fischer公司），IKA-T25分散机（德国IKA公司），Elan-DRCII电感耦合等离子体质谱仪（美国Perkin Elmer公司），Beckmann计数器（美国Beckmann公司），Vevo2100超声扫描仪（加拿大Visualsonics公司）。

2 方法

2.1 不同粒径气泡的制备在含有0.02%表面活性剂Tri-tonx-100的酸性水溶液（pH=2.5）中加入单体BCA，搅拌1 h后形成微泡悬浮液，合成了PBCA微气泡。悬浮液经过浮悬过程，将充满空气的微气泡与无空气的微气泡分离。将充满空气的PBCA微气泡转移到50 mL的离心管中，用离心机以500～10 000 r/min的速度进行离心后得到PBCA纳米气泡。研究不同的离心条件之下得到的气泡的粒径大小。

2.2 含铁聚合物纳米气泡（UPNBs）的制备取300 mL去离子水和Triton X-100（3 mL，5.0 mmol/mL）放置于烧杯中在室温下搅拌，向烧杯中滴加盐酸（1 mol/mL）调节pH值至2.5。随后，将10 mL预先制备的USPIO纳米粒子悬浮液加入混合物中，搅拌2 min后，用注射器滴加28.3 mmol/L BCA 3 mL，然后在室温下机械搅拌（4 000 r/min）1 h。混合液静置至泡沫沉降后，将乳化液转移到1 L分离漏斗中，重力浮选4 d。丢弃底部的清澈溶液，上层固体泡沫被重新悬浮在0.02%的Tritonx-100（pH=7.0）中。该工艺重复3次后，进行离心，纯化UPNBs悬浮液。500 r/min离心UPNBs悬浮液20 min，收集上层白色凝固气泡，再将其分散于0.02% Tritonx-100溶液（pH=7.0，50 mL）中，重复3次后保存于4 ℃。

2.3 UPNBs的表征用电感耦合等离子体质谱仪测定不同配料所制备的纳米气泡中铁的含量，每批测定一式三份，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1%。用计数器分析UPNBs的平均直径和浓度。

2.4 US检测将不同粒径气泡（40个/mL）分散于2.5%（w/v）明胶水溶液中制备成超声体模，明胶固定在成像面板上，换能器（中心频率为25 MHz）垂直定位于明胶体模。首先在一个预定好的4.5 s连续成像模式中运行超声成像，然后用一个破坏性脉冲（高机械指数）来测量背景信号。在凝胶体模上随机选取5个不同位置（15 mm×15 mm）作为感兴趣区域（region of interest，ROI），分别测量PBCA-纳米气泡、PBCA微泡和UPNB聚合气泡被破坏前后的信号强度（signal intensity，SI）变化趋势。对比强度（contrast intensity，CI）是通过从总SI（气泡破坏前）中扣除背景信号（气泡被破坏后）来计算的。

3 结果和讨论

3.1 气泡制备方法的优化前期报道指出由于材料和制备工艺的不同，气泡在粒径和成像效果上有很大的差异[5-6]。在本研究中，我们首先采用一锅乳化聚合法把PBCA制备成气泡，然后采用简单的机械搅拌法制备纳米气泡[7]。如表1所示，随着搅拌速度从500 r/min增加到10 000 r/min，气泡的尺寸从纳米级（45 nm）变为微米级（2.34 μm），因此可以通过调整搅拌速度来制备不同尺寸的气泡，以满足超声造影的不同需求。通过对搅拌所形成的气泡进行再离心，气泡尺寸从2.34 μm减小到900 nm，且随着离心时间的增加，气泡尺寸呈现出一个平台，这说明用这种方法获得更小的气泡是不可行的，见表2。重要的是，纳米气泡和微泡都表现出长期稳定性，微泡的大小在12个月内从2.34 μm变化到2.11 μm，纳米气泡的大小在4个月内从197.2 nm变为209.2 nm。此结果也与VAN EETEN等[8]的发现相符合，即气泡的平均尺寸受旋转速度、气体流量、流体密度和黏度的影响。纳米气泡于2004年首次应用于超声波，OEFFINGER等[2]开发出一种含有全氟丙烷的纳米级造影剂，其粒径大小为380 nm至780 nm，并有良好的超声波对比度。这些具有纳米级尺寸的气泡被定义为纳米气泡。它可以向肿瘤组织内渗出。由于肿瘤血管缺乏紧密连接，纳米气泡可在肿瘤组织中积累从而实现被动靶向成像[9-10]。另一方面，通过表面修饰，纳米气泡也可以识别肿瘤表面的特定分子，并与其结合，实现主动靶向成像或肿瘤特异性成像。因此，纳米气泡在生物医学领域有着广泛的应用[11]。微泡作为超声分子成像的造影剂和载体，它被用作血池造影剂难以通过病变组织的血管壁，因此尽可能减少微泡大小使之能够透过血管壁到达组织是非常必要的[12]。

表1 不同搅拌速度下气泡粒径的大小

表2 不同离心时间下气泡粒径的大小

3.2 不同粒径气泡在超声成像中的信号强度采用超声体模成像技术，研究了超声场中不同大小气泡的增强效果。通过计算CI来定量评价它们在超声波中产生背向散射信号的能力。结果显示，粒径为45 nm的气泡具有极弱的信号，随着气泡粒径增加，超声信号逐渐增加，当气泡粒径增加至312.2 nm时，其产生的信号与微泡（2.34 μm）产生的信号相当，见图1。这证实了气泡粒径尺寸越小，背向散射信号越弱[13]，同时说明了适当粒径的纳米气泡可具有微泡成像信号强的优点。对比增强超声是利用造影剂增强病变与周围组织之间的超声回波信号，检测和诊断疾病的技术[14]。

图1 不同尺寸纳米气泡在超声体模实验中的成像对比强度

3.3 不同含铁浓度的UPNBs的表征为了实现MRI/US双重成像，必须为MRI和US模式开发一种对比剂[15-16]。SONG等[17]构建了具有MR T2成像功能和US图像对比度的超顺磁性自组装微泡（superparamagnetic self-assembled microbubbles，SAMBs）作为MRI/US双重造影剂，新型造影剂在体内具有良好的生物相容性。因此，构建一种应用于MRI/US的混合造影剂是可以实现的，但大多数研究[18]都使用微米级的气泡作为双重造影剂的基础，而后者仅限于血液池。因此，制备纳米级别的双重造影剂是必要且可行的[19]。

本研究结果显示了4 000 r/min搅拌速度制备的不同铁含量的UPNBs的性质。当杂化气泡中铁的含量越高，水溶液颜色越暗。杂化气泡里铁的含量为3.76 mg/L时，其粒径为342 nm，当铁含量增加至44.92 mg/L时，其粒径为346 nm，只有小幅度的变化，这说明了铁的含量对聚合气泡粒径大小没有明显的影响。把含铁量不同的杂化气泡制备成成像体模，在相同超声成像条件下，与单纯的PBCA纳米气泡相比，铁含量不同的纳米气泡产生了相似的背向散射信号。这表明纯纳米气泡是超顺磁性氧化铁合适的载体，含铁的杂化气泡有良好的背向散射能力，这使得UPNBs可以作为核磁共振与超声双模态成像的造影剂。见图2。