黄芪总皂苷调节环状RNA34116表达阻止肝纤维化进展

周玉平，杨萍，唐春兰，璩辉，吕雪幼，胡桂梅

（1.宁波大学医学院附属医院 消化内科，浙江 宁波 315020；2.宁波卫生职业技术学院 护理学院，浙江宁波 315100；3.宁波大学医学院 预防医学系，浙江 宁波 315211）

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化、肝癌、肝衰竭方向发展过程中的共同病理阶段。我国是肝病大国，尤其是慢性乙肝患者数量巨大，脂肪肝等非感染性慢性肝病也日趋增多，因而在我国防治肝纤维化的任务尤为艰巨[1-2]。虽然关于肝纤维化的基础和临床研究取得了诸多进展，但现代医学干预肝纤维化进展仍局限于病因学的治疗，临床上仍缺乏抗肝纤维化的有效化学或生物药物[3]。中医药是解决肝纤维化难题的有效途径。黄芪总皂苷（astragalosides，AST）是黄芪的主要药效成分，具有显著的抗肝纤维化作用，但其效应机制有待进一步研究。本研究结合分子生物学领域非编码RNA的最新研究成果，从环状RNA（circular RNA，circRNA）角度在转录水平解析AST抗肝纤维化作用机制。课题组前期通过circRNA芯片分析发现，mmu_circ_34116是肝纤维化模型肝组织中变化最为显著的circRNA，但AST是否能调节circRNA表达尚未见报道，本研究拟初步探讨AST对其表达的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 C57BL/6雄性小鼠，SPF级，体质量18～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK（京）2016-0006，饲养于宁波大学实验动物中心。本研究获得宁波大学动物伦理委员会批准同意。AST，批号H-045-160721，纯度98.87%，购自成都瑞芬思生物科技有限公司。索拉菲尼，批号S5080，购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 主要试剂和仪器 四氯化碳（CCl4）分析纯购自上海国药集团化学试剂有限公司。苏木精、丽春红、苯胺蓝均购自美国Sigma公司。谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、白蛋白（albumin，ALB）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。RNA-hold液购自北京全式金生物公司。TRIZOL购自美国Invitrogen公司。反转录试剂盒GoScriptTMReverse Transcription System、实时荧光定量PCR试剂盒GoTaq®qPCR Master Mix购自美国Promega公司。Agilent-Mx3005P实时荧光定量PCR仪为美国安捷伦公司产品。PCR小鼠引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，引物序列见表1。

1.3 动物造模和标本取材 实验小鼠适应性喂养3 d，随机分为正常组、CCl4模型组、CCl4+AST组、CCl4+索拉菲尼组，每组8只。除正常组外的小鼠按

表1 PCR所用引物序列

1.4 肝组织病理学观察 制作肝组织石蜡切片，行HE染色和Masson染色，观察组织炎症和胶原增生情况。组织切片由2位病理专家盲法阅片。Masson染色时，胶原纤维呈蓝色或深蓝色，用Image-Pro Plus 6.0软件测量胶原纤维的面积，每个样本取5个视野，计算每个标本的胶原纤维总面积（μm2）。

1.5 血清肝功能检测 采用试剂盒法，严格按照说明书进行操作。

1.6 Real time PCR Trizol法提取小鼠肝组织总RNA，取2 μg总RNA反转录成cDNA（20 μL体积），5倍稀释后-20 ℃保存。PCR扩增反应体系为20 μL，条件设置为：95 ℃预变性5 min；40个PCR循环（95 ℃变性10 s，60 ℃退火60 s）。经内参GAPDH校正，采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。轻，见少量炎症细胞浸润。见图1。

1.7 统计学处理方法 采用SPSS19.0软件进行统计学分析。计量资料以形式表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD法进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组肝组织炎症反应病理结果比较 HE染色显示，正常组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索由中央静脉向四周放射，中央静脉、汇管区动静脉以及胆管结构正常；CCl4模型组小鼠肝细胞广泛坏死，汇管区可见大量的炎性细胞浸润；与CCl4模型组比较，CCl4+AST组和CCl4+索拉菲尼组小鼠肝细胞坏死较体质量以15% CCl4-橄榄油溶液2 mL/kg，腹腔注射，每周3次，共5周，正常组不处理。

根据课题组前期工作基础，CCl4+AST组每天给药剂量为164 mg/kg，CCl4+索拉菲尼每天剂量为4 mg/kg，药物用蒸馏水溶解，配置成合适混悬液灌胃。正常组和CCl4模型组以等体积蒸馏水灌胃，自造模第3周首日开始灌胃给药，每日1次，给药3周。5周末采集小鼠肝脏，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，下腔静脉采血，切取肝脏最大叶放入4%多聚甲醛固定用于石蜡切片；其余肝组织投入液氮中速冻后转入-80 ℃长期保存备用。

2.2 4组肝组织胶原沉积结果比较 正常组小鼠仅在肝脏的汇管区以及中央静脉周围见少量胶原纤维；CCl4模型组小鼠纤维间隔增宽致密，形成大小不一的完整假小叶结构；与CCl4模型组比较，CCl4+AST组和CCl4+索拉菲尼组小鼠肝组织胶原纤维间隔明显变窄、减少，少见完整的假小叶结构，见图2。胶原纤维面积半定量分析结果显示：与正常组比较，CCl4模型组胶原面积显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；与CCl4模型组比较，CCl4+AST组、CCl4+索拉菲尼组胶原面积显著减少，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

2.3 4组血清肝功能指标的比较 与正常组比较，CCl4模型组血清ALT、TBil水平均显著上升，差异有统计学意义（P＜0.01）；而ALB水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与CCl4模型组比较，CCl4+AST组和CCl4+索拉菲尼组ALT、TBil活性均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；ALB水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.4 4组肝组织mmu_circ_34116表达水平的比较与正常组比较，CCl4模型组肝组织mmu_circ_34116表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与CCl4模型组比较，CCl4+AST组mmu_circ_34116表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与CCl4模型组比较，CCl4+索拉菲尼组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

图1 4组肝组织炎症反应的病理结果（HE染色）

图2 4组对肝组织胶原沉积的病理结果比较（Masson染色）

表2 4组肝组织胶原沉积、血清肝功能指标和mmu_circ_34116表达水平的比较（每组n=8，

表2 4组肝组织胶原沉积、血清肝功能指标和mmu_circ_34116表达水平的比较（每组n=8，

与正常组比：aP＜0.01；与CCl4模型组比：bP＜0.01，cP＜0.05

正常组 1 070.0± 768.4 24.85±2.28 7.53±0.83 29.13±2.03 2.21±0.13 CCl4模型组 29 116.6±12 633.8a 57.07±5.96a 13.72±1.09a 27.58±1.20 0.34±0.11a CCl4+AST组 13 252.1± 4 205.6b 43.71±1.33b 10.63±1.12b 29.18±1.17 1.16±0.21b CCl4+索拉菲尼组 17 062.1± 3 674.3c 35.01±2.59b 9.45±0.65b 28.08±1.23 0.41±0.15 F 22.246 212.221 59.944 2.361 253.225 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.093 ＜0.01

3 讨论

中医药防治肝纤维化、肝硬化历史悠久，临床和基础研究均显示出了其良好的前景[4]。中医学无肝纤维化和肝硬化病名，根据其临床特点，肝纤维化多属于中医“胁痛”“积聚”范畴[5]，正虚血瘀是本病的基本病机特点。张华等[6]结合古典文献研究及近现代名中医认识，在深入系统的临床和基础研究基础上，提出了“血瘀为积之标，虚损乃积之本”的“虚损生积”病机学说，得到了学术界的广泛认可。黄芪为膜荚黄芪的根，具有补气固表、托毒生肌、利水等功效。《本草纲目》谓之“可治一切气衰血虚之证”，与肝硬化“虚损生积”病机特点相对应，是临床防治肝硬化方剂如黄芪汤、当归补血汤、861方等名方的主药。马红等[7]通过动物实验证实了单味黄芪对肝纤维化具有良好的治疗作用。AST是黄芪的主要有效成分[8]，属于单味药物的组分复方配伍形式。有研究报道，AST在体内能抑制多种动物模型的肝纤维化进展[9-10]。本研究通过经典的CCl4小鼠模型的干预实验，再次证实AST能显著抑制肝纤维化的进展，与上述文献报道结果一致。

近年来，随着RNA测序技术和生物信息学的发展，研究者发现了ncRNA家族的新成员circRNA，研究证实，circRNA在人类细胞中广泛存在，并且在调控人类基因中潜能巨大，circRNA的研究成了ncRNA研究领域的最新焦点之一，circRNA的生物学功能研究进展迅速[11]。目前对于circRNA与疾病的研究主要集中在肿瘤领域，circRNA与肝脏疾病的研究目前报道不多，已有的研究主要集中在原发性肝癌领域[12]。本课题组报道了小鼠肝纤维化模型肝组织circRNA的表达谱变化，通过基因芯片技术初步筛选出了肝组织差异表达的circRNA共有69个，其中mmu_circ_34116是变化最为显著的circRNA之一，CCl4模型组表达比正常组降低了4.67倍，提示其可能与肝纤维化发病机制有关，有可能是药物干预的靶标[13]。

本课题组进一步研究证实，mmu_circ_34116与肝星状细胞的活化有关，敲低肝星状细胞中mmu_circ_34116的表达可以显著抑制细胞的活化，这提示mmu_circ_34116可能是抗肝纤维化的有效靶点[14]。本研究通过小鼠肝纤维化模型证实，mmu_circ_34116在模型中均显著降低。同时，我们通过AST的干预实验发现，AST能显著提高模型组降低的mmu_circ_34116的表达水平，我们推测这可能是AST抗肝纤维化在转录水平的机制之一。此外，我们发现阳性对照药索拉菲尼虽然也有较好的抗肝纤维化作用，但对mmu_circ_34116表达却无显著影响，这提示索拉菲尼的干预环节可能与circRNA这一转录水平的调节机制无关，而是作用于转录后环节如mRNA的翻译、信号通路蛋白的调控等环节[15-16]。这也从另一方面说明，中药组分在抗肝纤维化效应方面具有多层次、多环节、多靶点的优势。