电纺SF/bFGF复合膜片的制备及性能研究
2019-04-27魏琪杨滢田甜
魏琪 杨滢 田甜
摘 要：采用静电纺丝制备含有碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）和丝素蛋白（Silk fibroin，SF）的复合膜片（SF/bFGF）。利用扫描电镜研究SF/bFGF复合膜片的内部形态和结构，利用小鼠皮肤缺损修复实验分析SF/bFGF对小鼠皮肤缺损修复是否具有促进作用。结果表明，SF/bFGF复合膜片对小鼠皮肤缺损有促进修复作用。
关键词：静电纺丝；丝素蛋白；碱性成纤维细胞生长因子
丝素蛋白（SF）来源于蚕茧，是一种天然结构蛋白，生物相容性好且无毒副作用，有利于细胞贴附和伸展，具有良好的生物降解性，已被广泛应用于生物医学领域，如作为医学材料、药物载体、细胞培养基质及手术缝合线等，在服装领域、食品领域也有应用。尤其在生物医学材料领域的应用日趋广泛和深入，SF可被制作成多种形态，比如水凝胶、与其他材料复合形成微球或3D材料或者通过静电纺丝（形成多孔纳米材料等。多孔的丝素蛋白材料可被设计并融合各种生长因子用于组织修复。比如，2014年Tony M.Dinis等人通过丝素蛋白静电纺丝形成含有神经生长因子（Nerve growth factor，NGF）、睫状神经生长因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）的纳米纤维，再通过卷曲形成3D支架用于神經修复。当大鼠的原代神经细胞种于纳米纤维上，可使突起的长度增加3倍。2014年Chen等整合双相磷酸钙（BCP）与重组人骨形成蛋白2（rhBMP-2）/SF 微球形成BCP/rhBMP-2/SF植入山羊椎体的不同部位看骨的再生情况，在第三个月BCP/rhBMP-2/SF组就可以观察到非层板骨，椎体不同空间充满了大量的新生骨小梁；而BCP/rhBMP-2组到第六个月才出现大量的骨小梁及成熟的板层骨。在众多生长因子中，bFGF在损伤修复中的研究相对比较深入，已被用于多种创伤治疗，bFGF在皮肤缺损修复中应用的比较多，比如程飚等将bFGF敷于大鼠深Ⅱ度烫伤的皮肤，发现能促进损伤组织的修复；Sakamoto等将明胶溶液与bFGF溶液混合后与1%的戊二醛交联用于小鼠皮肤缺损修复，结果显示交联混合液促进皮肤缺损愈合。但是目前还没有SF静电纺丝作为bFGF的承载材料。因此，本实验拟通过静电纺丝制备SF/bFGF复合膜片，以期促进皮肤缺损的修复。
一、实验部分
（一）材料、试剂与设备
（1）蚕茧
陕西省安康市安康学院重点蚕桑实验室提供。
（2）实验动物
4周龄昆明小鼠，购自第四军医大学动物中心。
（3）试剂
戊巴比妥钠（Sigma），BCATM蛋白检测试剂盒（Thermo），胰酶（Hyclone），DMEM（Gibco），非必需氨基酸（Hyclone），PBS（Hyclone），胎牛血清（FBS，Gibco），Na2S（天津天力），其他试剂均为分析纯试剂。
（4）仪器
倒置显微镜（Nikon），冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司），真空干燥箱（Vacucell 22L，MMM，德国），扫描电子显微镜（SEM，Philips）超净台（海尔），孵箱（Binder）等。
（二）方法
（1）SF/bFGF复合膜片的制备
将丝素蛋白冻干品配成浓度为28%的溶液，加入bFGF，使bFGF的浓度为10μg/cm2，设置距接收屏的距离为7cm及电压为20kv/cm，进行静电纺丝获得SF/bFGF复合膜片。
（2）昆明小鼠皮肤缺损修复实验
实验前用戊巴比妥钠麻醉小鼠，经脱毛消毒后在背部制造直径约1.2cm的圆形缺损，将SF/bFGF复合膜片和SF膜片各贴于昆明小鼠皮肤缺损部位，无贴附组即con组，每组6只昆明小鼠，单笼饲养，每天给小鼠伤口采照，统计伤口的愈合情况。
（3）修复面积的统计学分析
采用IBM SPSS Statistics 20软件进行小鼠伤口修复面积进行统计分析，使用单因素方差分析各处理之间的显著性，当P<0.01，具有极显著性差异；当0.01
二、结果与分析
（一）小鼠皮肤缺损修复实验结果
（1）昆明小鼠皮肤缺损修复面积的统计分析
缺损修复面积的统计分析显示，在缺损修复到第12d和18d时，SF/bFGF组比SF组和con组明显修复加快且修复率与con组具有极显著性差异（P<0.01）。这些统计数据与小鼠皮肤缺损修复大体观察结果一致。
三、结语
丝素蛋白来源于蚕茧，其经过脱胶、盐溶解和透析获得纯净的丝素蛋白，通过与bFGF混纺获得SF/bFGF复合膜片，扫描电镜结果显示纤维间有黏连推测复合膜片结构稳定，力学性能较好，SF/bFGF复合膜片是一种相对较好的载体材料。小鼠皮肤缺损修复差异统计结果显示，SF/bFGF和SF均能促进小鼠皮肤缺损修复，SF/bFGF尤为明显，虽然在con组修复的第六天表面看起来比实验组修复的快，可能的原因是在于制造缺损时con组小鼠皮肤处于紧绷的状态。整体结果说明通过静电纺丝获得的SF/bFGF复合膜片表现出了bFGF的天然活性，也说明以丝素蛋白作为bFGF的承载材料是可行的。
参考文献
[1] Gao Y.Y.，Wang Q.J.，Cui X.B.，et al.Controlled release of stromal cell-derived factor-1 from silk firoin-coated coils accelerates intra-aneurysmal organization and occlusion of neck remnant byrecruiting endothelial progenitor cells.Int J Clin Exp Pathol，2014，7（12）：8366-8380.
[2] Tony M.D.，Guillaume V.，Rodrigo R.J.，et al.Comp-lementary Effects of Two Growth Factors in Multifunctionalized Silk Nanofibers for Nerve Reconstruction，PLOS ONE，2014， 9（10）.
[3] Sakamoto M.，Morimoto N.，Ogino S.，et al.Efficacy of Gelatin Gel Sheets in Sustaining the Release of Basic Fibroblast Growth Factor for Murine Skin cted cell migration，Biomaterials，2005，26（16）：3227-3234.
基金项目：2017年国家级大学生创新创业训练计划（编号：201711400005）；2018年省级大学生创新创业训练计划（编号：201843005）。
