黑豆皮红色素的不同提取方法对抗氧化性的影响

明倩伊，张海容

(1.山西医科大学 影像学系，山西 太原 030001；2.忻州师范学院 生化分析技术研究所，山西 忻州 034000)

黑豆是豆科大豆属植物大豆的黑色种子，营养丰富，必需氨基酸齐全、比例合适，不仅具有营养价值而且具有保健功能，被国家卫生部列为“既是食品又是药品的农产品”。而且随着分析技术和毒理学的不断发展，人们发现大部分合成色素对人体有致癌作用，因此黑豆作为一种新型的天然色素源也得到了重视[1]。黑豆皮红色素[2-5]为花色苷类色素， 包括矢车菊素-3-葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-半乳糖苷。现已证实其主要着色成分为矢车菊素-3-乳糖苷，分子式为C21H21O11，相对分子质量为449.39，分子结构如图1。如果R=葡萄糖，R1=H 时为矢车菊素-3-葡萄糖苷，R1=OH 时为飞燕草素-3-葡萄糖苷； 如果R=半乳糖、R1=H 时为矢车菊素-3-半乳糖苷。

图1 黑豆皮色素的化学结构

据文献报道，黑豆皮红色素具有清除羟基自由基、抗氧化、延缓衰老等重要的生理活性，本文对比研究了微波提取、超声波提取、索氏提取三种不同提取方法对黑豆皮红色素的抗氧化性，为深入研究与开发天然红色素提供实验依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

主要试剂：无水乙醇，分析纯，天津风船化学试剂科技有限公司；硫酸亚铁铵，化学纯，北京化学试剂三厂；30%过氧化氢，分析纯，天津市北辰方正试剂厂；焦性没食子酸，化学纯，贵州遵义市第二化工厂；水杨酸，分析纯，天津风船化学试剂科技有限公司；其余试剂皆分析纯。

主要仪器: AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海有限公司)DRT-YW型电热套，巩义市予华仪器有限责任公司；YXJ-2A离心机，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；SHZ-D循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；可见分光光度计，上海光谱SP-723；LG微波，天津乐金电子电器有限公司；KQ-100-DB 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 索氏浸提取法

实验通过对黑豆的脱皮、提取溶剂的类型、浓度、料液比及浸提温度、次数、pH值进行工艺参数的正交试验，确定最佳提取方法和提取条件为：50%的乙醇水溶液作为浸提液，温度为70 ℃，料液比为1∶100(g/mL)，时间90 min，pH值=1的条件下提取两次。

1.2.2 微波辅助提取法

通过正交试验确定了最佳工艺条件：以0.1 mol/L 盐酸-75 %乙醇(体积分数为1∶1)为提取剂，微波功率385 W、料液比1∶40、时间120 s、提取2 次。

1.2.3 超声波辅助提取法

通过正交试验法对影响色素提取效果的几个主要因素，即超声功率、温度、时间、pH值和液固比进行了优化，结果表明： 在原料用量0.5 g时，以60%乙醇(pH值1.5)为提取溶剂，50 ℃水浴提取60 min，超声功率80 W、液固比30 mL/g，色素的提取率较高。

1.2.4 自由基清除率的测定方法[6-8]

1.2.4.1 DPPH法

原理：DPPH·是一个大分子的稳定自由基抗氧化剂预期作用模式为：AH + DPPH·→ DPPH-H + A。取提取液1 mL稀释到50 mL的容量瓶，然后吸取一定量稀释液，然后加2 mL 2×10-4mol/L 的DPPH·溶液到10 mL比色管中，摇匀，最后用蒸馏水定容到10 mL，30 min 后用提取液作参比，测定样品吸光度，测定2 mL 2×10-4mol/L DPPH·液定容到10 mL后的吸光度(A对照)，DPPH法根据下面的公式计算清除率：

式中：A参比为加蒸馏水时的吸光度；

A对照为加入DPPH·体系的吸光度；

A样参为加入不同提取液与蒸馏水后的吸光度；

A样品为加入不同提取液后DPPH·体系的吸光度。

1.2.4.2 水杨酸法

在10 mL 比色管中依次加入不同体积提取液，7.5 ×10-3mol/L 的硫酸亚铁铵1 mL，0.3% 的H2O27.5 mol/L 的水杨酸各1 mL，并定容至10 mL，30 min 后，用提取液作参比，测其在510 nm 处的吸光度。水杨酸法清除率计算公式为：

式中：A参比为加入Fe2+、H2O2时的吸光度；

A没对照为加入Fe2+、H2O2水杨酸后的羟自由基体系的吸光度；

A样参为加入Fe2+、H2O2不同提取液后的吸光度值；

A样品为加入Fe2+、H2O2不同提取液、水杨酸后的羟自由基体系的吸光度。

1.2.4.3 邻苯三酚法

分别取干净的10 mL比色管，依次加入不同体积提取液，2 mL pH值8.43的缓冲溶液，NBT 2.5 mL，再加1 mL邻苯三酚，摇匀，20min后，在波长560 nm处测其吸光度。

O2-·清除率计算公式为：

式中： A参比为加入邻苯三酚、缓冲溶液的吸光度；

A对照为加入邻苯三酚、缓冲溶液、NBT的吸光度；

A样参为加入邻苯三酚、缓冲溶液、提取液的吸光度；

A样品为加入邻苯三酚、缓冲溶液、提取液、NBT的吸光度。

3 三种不同提取方法提取黑豆皮色素的抗氧化性测定

表1 不同方法对微波、超声以及索氏法提取物抗氧化性比较

注：表中y为清除率；x为不同方法提取液体积。

由实验结果可知：采用DPPH法测定黑豆皮红色素抗氧化性，微波辅助提取物、超声波辅助提取物、索氏提取物的清除率都是随着体积的增加而增大；取相同体积的提取液时，微波辅助提取液的清除率最高，超声辅助提取液次之，索氏提取液清除率最低。同时当清除率达到70%时微波辅助提取物需0.563 mL，超声波提取物需0.851 mL，索氏提取物需1.454 mL，提取物的抗氧化能力顺序为：微波法>超声法>索氏提取法，微波辅助提取法黑豆皮色素提取物对DPPH自由基有较强的抗氧化性。

采用水杨酸法测黑豆皮红色素对·OH自由基的清除率，超声波辅助提取液的效果最佳，只需要2.885 mL清除率就可达到70%，微波辅助提取液需4.491 mL，索氏提取液需8.577 mL。提取物的抗氧化能力顺序为：超声法>微波法>索氏提取法，超声法提取物黑豆皮色素对·OH自由基有较强的抗氧化性。

采用邻苯三酚法测黑豆皮红色素对超氧阴离子O2-·的清除率，取相同体积的提取液，索氏提取法的清除率最高，当清除率达70%时，索氏提取液需0.117 mL，超声波辅助提取液需0.203 mL，微波辅助提取液需0.96 mL。提取物的抗氧化能力顺序为：索氏提取法>超声法>微波法，索氏提取法提取物黑豆皮色素对超氧阴离子O2-·有较强的抗氧化性。

研究表明:黑豆皮红色素具有一定的抗氧化性，对提高人体免疫、保护人类健康有极其重要的生理功能。由于不同提取方法对黑豆皮细胞结构的破坏程度不同，提取液中抗氧化活性成分的含量存在差别，导致不同方法的提取液对自由基的清除率不同。研究结果表明，微波提取液对DPPH自由基的清除率最高，采用水杨酸法清除·OH自由基时超声辅助提取液的清除效果最佳，但采用邻苯三酚法清除超氧负离子时索氏提取法清除率最高。实验结果对药品、化妆品、食品的研究与开发有重要的参考价值。