离舌橐吾中艾里莫酚烷型倍半萜类化学成分的研究

徐健龙，邹 坤，杨 迪，李文聪，乔 婷，卢 颖，程 凡，王 慧

三峡大学生物与制药学院 天然产物研究与利用湖北省重点实验室，宜昌 443002

菊科(Asteraceae)橐吾属(Ligularia)植物大约有150种，主要分布于亚洲，其中超过100种分布于中国各地区[1]。离舌橐吾L.veitchiana为菊科橐吾属植物，主要分布于云南西北部、四川、贵州、湖北西部、甘肃西南部、陕西南部等地，生于海拔1 400～3 300米的河边、山坡及林下；其味辛、苦，性温，入肺经，具有润肺下气、清热解毒、抗菌消炎、化痰止咳、活血止痛等功效；在民间主要用作治疗流行性感冒、咳嗽、溃疡和肺结核等症[2-3]。据文献报道，离舌橐吾化学成分主要为艾里莫酚烷型倍半萜类、苯并呋喃类和三萜类等化合物[3]。为了进一步研究离舌橐吾中艾里莫酚烷型倍半萜类化合物，本课题组对其醇提物乙酸乙酯部位进行了系统分离，从中分离得到13个艾里莫酚烷型倍半萜类化合物，分别鉴定为：eremophilenolide(1)，eremophila-7(11),9-dien-8-one(2)，eremophil-6-en-11-ol(3)，8-oxo-eremophil-6-en-11-one(4)，(6α,8α)-6-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8-olide(5)，8β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8α-olide(6)，6β-hydroxy-8α-methoxyeremophil-7(11)-12,8β-olide(7)，2α-hydroxyeremophil-11-en-9-one(8)，6β-methoxy-8β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8α-olide(9)，6β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8β-olide(10)，6β-hydroxy-8β-methoxyeremophil-7(11)-12,8α-olide(11)， 6β,8β-dihydroxyeremophil-7(11)-en-12,8α-olide(12)和6β,8α-dihydroxyeremophil-7(11)-en-12,8β-olide(13)。其中，化合物5和10互为非对映异构体，化合物7和11为一对非对映异构体，化合物12和13为一对非对映异构体。除化合物3和5外，其余化合物均为首次从该植物中分离得到。

图1 化合物1～13的化学结构Fig.1 Chemical Structures of compounds 1-13

1 材料

1.1 仪器与材料

Bruker AV 400 核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克公司)；Thermo Scientific ISQ LT单四极杆质谱仪(美国赛默飞世尔科技公司)；Dionex Ultimate 3000 型高效液相色谱仪(美国戴安公司)；LC-6AD高效液相色谱仪(日本岛津公司)；YMC-Pack ODS-A色谱柱(250 mm×10 mm，10 μm，半制备型；250 mm×4.6 mm，5 μm，分析型，日本 YMC公司)；AL204-IC 电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；低温冷冻干燥机(美国Labconco公司)；正相色谱硅胶(青岛海洋化工有限公司)；反相色谱硅胶(日本YMC公司)。薄层色谱硅胶板 GF254(青岛海洋化工厂)；高效液相用甲醇、乙腈均为色谱纯(美国TEDIA公司)，其他试剂均为分析纯(天津科密欧化学试剂有限公司)。

离舌橐吾药材于2015年7月采自湖北省神农架林区，经三峡大学生物与制药学院王玉兵博士鉴定为离舌橐吾L.veitchiana，植物标本(LV201510)存放于三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室。

1.2 细胞株

胃癌细胞HGC-27和宫颈癌细胞Caski均由三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室提供。

2 提取分离

取自然干燥的离舌橐吾药材1.45 kg，剪碎，用95%乙醇冷浸提取3次、每次48 h。提取液合并后减压蒸干。提取物经水混悬后，依次用石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将乙酸乙酯部位进行正相硅胶柱(200～300目)分离，以氯仿：甲醇(100∶0→1∶1)梯度洗脱，得Fr.1～127。TLC分析后，合并Fr.12-16(301.3 mg)，进行高效液相色谱半制备分离纯化(乙腈-水=58∶42，2.5 mL/min)，得到化合物1(3.8 mg)、2(10.3 mg)、3(3.9 mg)；合并Fr.19-26(173.1 mg)，进行高效液相色谱半制备分离纯化(乙腈-水=56∶44，2.5 mL/min)，得到化合物4(3.7 mg)；合并Fr.28-31，经反相硅胶柱(甲醇-水∶10%→100%)分离，得Frr.1～70，合并Frr.36-39(223.5 mg)，经半制备柱制备(乙腈-水=47∶53，2.5 mL/min)，得到化合物5(8.8 mg)、6(7.1 mg)、7(18.1 mg)和8(2.8 mg)；合并Frr.33-35(550.9 mg)，经两次半制备柱制备(乙腈-水=42∶58，2.5 mL/min)，得到化合物5(44.4 mg)、9(10.1 mg)、10(14.9 mg) 和11(36.3 mg)；合并Fr.34-37(932.6 mg)，经凝胶柱分离(甲醇∶氯仿=1∶1)，得Frr.1～57，合并Frr.25-29(359.8 mg)，经半制备柱制备(乙腈-水=55∶45，2.5 mL/min)，得到化合物12和13的混合物(共192.4 mg)。

3 结构鉴定

化合物1无色固体(CHCl3)；EI-MS：m/z234 [M]+，分子式C15H22O2；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.79(3H，d，J=6.5 Hz，15-CH3)，1.04(3H，s，14-CH3)，1.25(1H，m，H-3a)，1.35(1H，m，H-1b)，1.44(1H，m，H-3b)，1.46(2H，m，H-2)，1.62(1H，m，H-4)，1.68(1H，m，H-10)，1.74(1H，dd，J=13.2，10.8 Hz，H-9b)，1.81(3H，t，J=1.6 Hz，13-CH3)，1.85(1H，m，H-6b)，1.88(1H，m，H-1a)，2.09(1H，ddd，J=11.7，6.8，3.0 Hz，H-9a)，2.90(1H，d，J=13.8 Hz，H-6a)，4.64(1H，m，H-8)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：8.3(C-13)，16.1(C-15)，20.6(C-2)，21.7(C-14)，26.7(C-1)，30.0(C-4)，30.7(C-3)，35.1(C-9)，36.5(C-6)，39.9(C-5)，40.2(C-10)，80.5(C-8)，120.6(C-11)，161.3(C-7)，175.1(C-12)。以上数据与文献[5]对照基本一致，故确定化合物1为eremophilenolide。

化合物2无色油状物(CHCl3)；EI-MS：m/z218 [M]+，分子式C15H22O；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.95(3H，d，J=6.3 Hz，15-CH3)，0.97(3H，s，14-CH3)，1.83(3H，s，13-CH3)，2.09(3H，d，J=2.0 Hz，12-CH3)，5.74(1H，dd，J=1.7，0.7 Hz，H-9)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：15.4(C-15)，16.0(C-14)，22.0(C-12)，22.5(C-13)，26.5(C-2)，30.5(C-1)，32.5(C-3)，41.0(C-6)，41.8(C-5)，42.5(C-4)，126.1(C-9)，128.1(C-7)，142.2(C-11)，168.7(C-10)，192.3(C-8)。以上数据与文献[6]对照基本一致，故确定化合物2为eremophila-7(11),9-dien-8-one。

化合物3无色油状物(CHCl3)；EI-MS：m/z222 [M]+，分子式C15H26O；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.87(3H，d，J=6.4 Hz，14-CH3)，0.91(3H，s，15-CH3)，1.11(1H，m，H-8)，1.13(3H，s，12-CH3)，1.14(3H，s，13-CH3)，1.20(1H，m，H-3)，1.32(1H，m，H-10)，1.39(1H，m，H-1)，1.50(1H，m，H-3)，1.56(1H，m，H-4)，1.66(1H，m，H-1)，1.71(1H，m，H-8)，1.95(1H，m，H-2)，1.96(1H，m，H-9)，1.99(1H，m，H-2)，2.25(1H，m，H-9)，5.32(1H，s，H-6)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：16.0(C-14)，21.1(C-15)，25.1(C-2)，26.3(C-12)，26.7(C-1)，27.1(C-3)，27.5(C-13)，28.0(C-9)，34.0(C-4)，35.2(C-8)，37.7(C-5)，41.9(C-10)，72.8(C-11)，120.6(C-6)，143.8(C-7)。以上数据与文献[7]对照基本一致，故确定化合物3为eremophil-6-en-11-ol。

化合物4黄色油状物(CHCl3)；EI-MS：m/z240 [M]+，分子式C14H20O2；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.95(3H，d，J=6.8 Hz，14-CH3)，1.18(3H，s，13-CH3)，1.36(1H，m，H-3a)，1.38(1H，m，H-1b)，1.46(1H，m，H-3b)，1.49(1H，m，H-2a)，1.58(1H，m，H-2b)，1.75(1H，m，H-1a)，1.85(1H，m，H-4)，2.09(1H，m，H-10)，2.31(1H，dd，J=17.0，4.3 Hz，H-9b)，2.47(3H，s，12-CH3)，2.74(1H，m，H-9a)，7.50(1H，s，H-6a)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：16.0(C-14)，20.2(C-13)，20.3(C-2)，26.9(C-1)，30.2(C-3)，30.8(C-12)，35.6(C-4)，39.4(C-10)，39.7(C-5)，40.5(C-9)，137.0(C-7)，166.6(C-6)，197.7(C-8)，198.5(C-11)。以上数据与文献[5]对照基本一致，但文献未对此化合物进行命名，根据系统命名法，将化合物4命名为8-oxo-eremophil-6-en-11-one。

化合物5无色晶体(CHCl3)；EI-MSm/z：250 [M]+，分子式C15H22O3；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.78(3H，d，J=6.3 Hz，15-CH3)，1.11(3H，s，14-CH3)，1.85(3H，d，J=1.6 Hz，13-CH3)，4.69(1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，5.10(1H，ddd，J=10.6，6.9，1.8 Hz，H-8)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：8.7(C-13)，16.2(C-15)，16.3(C-14)，20.0(C-2)，25.8(C-1)，29.5(C-4)，30.6(C-3)，33.8(C-10)，35.0(C-9)，42.9(C-5)，70.0(C-6)，78.4(C-8)，121.7(C-11)，161.4(C-7)，174.7(C-12)。以上数据与文献[7]对照基本一致，故确定化合物5为(6α,8α)-6-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8-olide。

化合物6无色晶体(CHCl3)；EI-MS：m/z250 [M]+，分子式C15H22O3；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.79(3H，d，J=6.4 Hz，15-CH3)，1.05(3H，s，14-CH3)，1.80(3H，d，J=1.6 Hz，13-CH3)，2.12(1H，m，H-9b)，2.77(1H，d，J=13.7 Hz，H-9a)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：8.3(C-13)，16.0(C-15)，20.5(C-2)，21.5(C-14)，26.2(C-1)，29.6(C-4)，30.5(C-3)，35.0(C-6)，39.0(C-9)，39.5(C-10)，40.4(C-5)，103.9(C-8)，122.6(C-11)，159.1(C-7)，172.5(C-12)。以上数据与文献[8]对照基本一致，故确定化合物6为8β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8α-olide。

化合物7无色晶体(CHCl3)；EI-MS：m/z280 [M]+，分子式C16H24O4；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.80(3H，s，14-CH3)，1.00(3H，d，J=7.2 Hz，15-CH3)，3.18(3H，s，8-OMe)，4.97(1H，dd，J=5.0，2.2 Hz，H-6a)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：8.9(C-13)，15.6(C-15)，18.4(C-14)，20.0(C-2)，28.1(C-1)，28.6(C-3)，31.7(C-4)，35.9(C-10)，37.6(C-9)，45.6(C-5)，50.1(OMe)，70.7(C-6)，106.9(C-8)，126.3(C-11)，158.7(C-7)，171.9(C-12)。本文首次采用CDCl3为溶剂，得到了该化合物的13CNMR数据，其结构与文献[9]对照基本一致，故确定化合物7为6β-hydroxy-8α-methoxyeremophil-7(11)-12,8β-olide。

化合物8无色晶体(CHCl3)；EI-MS：m/z236 [M]+，分子式C15H24O2；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.80(3H，d，J=7.2 Hz，15-CH3)，1.03(3H，s，14-CH3)，1.75(3H，s，13-CH3)，4.06(1H，d，J=6.0 Hz，H-2)，4.74(1H，s，H-12a)，4.79(1H，s，H-12b)；13C NMR (CDCl3，100 MHz)δ：15.0(C-15)，20.6(C-13)，21.5(C-14)，26.5(C-1)，27.2(C-4)，37.8(C-3)，39.7(C-7)，41.2(C-5)，42.0(C-6)，46.5(C-8)，56.1(C-10)，65.3(C-2)，109.8(C-12)，147.3(C-11)，216.8(C-9)。本文首次采用CDCl3为溶剂，得到了该化合物的1H NMR和13C NMR数据，其结构与文献[10]对照基本一致，故确定化合物8为2α-hydroxyeremophil-11-en-9-one。

化合物9无色晶体(CHCl3)；EI-MS：m/z280 [M]+，分子式C16H24O4；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.78(3H，d，J=5.4 Hz，15-CH3)，1.10(3H，s，14-CH3)，1.91(3H，s，13-CH3)，2.08(2H，m，H-9)，3.36(3H，s，OCH3)，4.11(1H，s，H-6)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：8.4(C-13)，16.1(C-15)，16.3(C-14)，20.0(C-2)，25.5(C-1)，29.3(C-4)，30.4(C-3)，34.4(C-10)，39.2(C-9)，43.1(C-5)，58.4(OCH3)，80.7(C-6)，103.7(C-8)，127.0(C-11)，153.9(C-7)，171.1(C-12)。以上数据与文献[8]对照基本一致，故确定化合物9为6β-methoxy-8β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8α-olide。

化合物10无色晶体(CHCl3)；EI-MS：m/z250 [M]+，分子式C15H22O3；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.81(3H，s，14-CH3)，1.01(3H，d，J=7.2 Hz，15-CH3)，2.06(3H，d，J=2.0 Hz，13-CH3)，4.80(1H，m，H-8)，5.07(1H，s，H-6)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：9.0(C-13)，15.2(C-15)，19.0(C-14)，20.2(C-2)，28.4(C-1)，28.4(C-3)，31.8(C-4)，35.3(C-10)，35.9(C-9)，44.8(C-5)，71.4(C-6)，77.5(C-8)，122.2(C-11)，162.6(C-7)，175.0(C-12)。以上数据与文献[8]对照基本一致，故确定化合物10为6β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8β-olide。

化合物11无色油状物(CHCl3)；EI-MS：m/z280 [M]+，分子式C16H24O4；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.76(3H，d，J=6.1 Hz，15-CH3)，1.09(3H，s，14-CH3)，1.88(3H，s，13-CH3)，2.74(1H，d，J=9.8 Hz，6-OH)，3.29(3H，s，8-OCH3)，4.51(1H，d，J=9.1 Hz，H-6a)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:8.7(C-13)，16.2(C-15)，16.3(C-14)，19.9(C-2)，25.6(C-1)，29.5(C-4)，30.6(C-3)，33.4(C-10)，36.5(C-9)，43.4(C-5)，51.1(OCH3)，70.8(C-6)，106.5(C-8)，126.2(C-11)，154.2(C-7)，171.1(C-12)。本文首次采用CDCl3为溶剂，得到了该化合物的13CNMR数据，其结构与文献[9]对照基本一致，故确定化合物11为6β-hydroxy-8β-methoxyeremophil-7(11)-12,8α-olide。

化合物12无色晶体(DMSO)；EI-MS：m/z266 [M]+，分子式C15H22O4；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：0.71(3H，d，J=5.7 Hz，15-CH3)，0.99(3H，s，14-CH3)，1.89(3H，s，13-CH3)，4.48(1H，s，H-6)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：8.7(C-13)，16.6(C-15)，16.7(C-14)，20.1(C-2)，25.8(C-1)，29.1(C-4)，30.9(C-3)，33.9(C-10)，39.4(C-9)，43.1(C-5)，69.1(C-6)，105.3(C-8)，123.6(C-11)，157.4(C-7)，171.6(C-12)。以上数据与文献[8]对照基本一致，故确定化合物12为6β,8β-dihydroxyeremophil-7(11)-en-12,8α-olide。

化合物13无色晶体(DMSO)；EI-MS：m/z266 [M]+，分子式C15H22O4；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：0.67(3H，s，14-CH3)，0.92(3H，d，J=7.2 Hz，15-CH3)，1.74(3H，s，13-CH3)，4.48(1H，s，H-6)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：9.0(C-13)，15.9(C-15)，18.8(C-14)，20.3(C-2)，28.6(C-3)，28.8(C-1)，31.2(C-4)，35.9(C-10)，39.5(C-9)，45.6(C-5)，68.9(C-6)，104.9(C-8)，122.8(C-11)，162.7(C-7)，172.3(C-12)。以上数据与文献[8]对照基本一致，故确定化合物13为6β,8α-dihydroxyeremophil-7(11)-en-12,8β-olide。

4 体外细胞毒活性筛选

采用MTT比色法测定单体化合物对胃癌HGC-27细胞和宫颈癌Caski细胞的细胞毒活性。

收集处于对数生长期的胃癌HGC-27细胞和宫颈癌Caski细胞，制成单细胞悬液，用培养液稀释，使细胞浓度为(0.8～1)×105个/mL左右，每孔100 μL接种于96孔板，四周用PBS液封，置于37 ℃，5% CO2饱和湿度培养箱中孵育待细胞贴壁后，约10小时后将不同浓度(终浓度，6.25、12.5、25、50、100 μM/L)的化合物加入孔中，每一浓度设置3个复孔，每孔终体积为200 μL，另设空白对照孔若干个，空白孔加100 μL的培养液。培养48 h后取出96孔板，在倒置显微镜下观察，对染菌和药物未溶解的细胞孔做好标记。之后在超净工作台中每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)，继续培养4 h后，小心吸去96孔板内培养液，每孔加入150 μL的DMSO，低速震荡5 min，使紫色结晶完全溶解。用酶标仪在波长490 nm下测定吸光值，计算出细胞抑制率:细胞生长抑制率=(正常细胞OD值-提取物处理组OD值)/提取物处理组OD值×100%，每次MTT实验重复3次。

结果表明，所有化合物对胃癌细胞HGC-27和宫颈癌细胞Caski未显示细胞毒作用(IC50>50 μM)。

5 结论

离舌橐吾在我国分布广泛，民间用于治疗流行性感冒、咳嗽、溃疡和肺结核等症。国内外学者从离舌橐吾中分离鉴定了倍半萜类，苯并呋喃类、三萜皂苷类、甾醇类、脂肪酸类等化合物，并发现其具有抗肿瘤、抗菌和抗炎等多种生物活性。倍半萜类化合物是其主要次级代谢产物。为进一步研究离舌橐吾的倍半萜类化合物，我们对离舌橐吾醇提物乙酸乙酯部位进行了深入研究，从中分离鉴定了13个艾里莫酚烷型倍半萜类化合物(包括3对非对映异构体)，其中11个为首次从该植物分离得到。采用MTT法评价了所得单体化合物的抗肿瘤活性，结果表明，所有化合物均未表现出显著活性。该研究成果不仅丰富了离舌橐吾来源的倍半萜类化合物种类，而且为离舌橐吾中次级代谢产物的进一步研究奠定了基础。