不同水平低聚木糖对凡纳滨对虾生长、免疫及抗氨氮胁迫能力的影响

2019-04-27王安琪孙金辉乔秀亭程镇燕

中国饲料 2019年7期

王安琪，郭立，崔培，孙金辉，乔秀亭，程镇燕

（天津农学院水产学院，天津西青 300380）

功能性寡糖作为饲料添加剂，能够有效促进肠道有益菌的增殖，从而阻止或排除病原菌在肠道的定植、黏附；还可以作为免疫源，引起动物自身的免疫应答反应，提高自身免疫力（杨曙明，1999）。低聚木糖又称寡木糖，是较为常见的功能性寡糖，与其他功能性寡聚糖相比，低聚木糖具有独特的酸稳定性和热稳定性，且很难被动物的消化酶分解，在饲料中少量添加能发挥很好的作用。目前，已有报道显示，饲料中添加低聚木糖可以提高异育银鲫（Carassius auratusgibelio）增重率、肠道淀粉酶活性和肝胰脏蛋白酶活性（熊沈学，2005）；可以提高大菱鲆（Scophthalmusmaximus）增重率、特定生长率并降低饲料系数（李勇等，2006）；可以提高草鱼（Ctenopharyngodon idellus）血清总蛋白水平，降低尿素氮水平和胆固醇含量（褚武英等，2008）；可以显著提高欧洲鲈鱼（Dicentarchus labrax）生长性能及免疫能力（Torrecillas等，2007）；可以显著提高奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus）幼鱼肠道和肝胰脏的蛋白酶和脂肪酶活力（张荣斌等，2011；强俊等，2009）以及对凡纳滨对虾（L.vannamei）的生长及免疫有明显的促进作用等（符广才等，2004）。但对凡纳滨对虾抗氨氮胁迫能力的研究鲜见报道。本试验拟在基础饲料中添加不同水平低聚木糖，通过养殖试验分析低聚木糖对凡纳滨对虾生长、免疫及抗氨氮胁迫能力的影响，以期为低聚木糖在凡纳滨对虾饲料中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计试验用凡纳滨对虾购自天津恒仟水产养殖场，正式试验前暂养5 d，使凡纳滨对虾适应养殖环境。选择健康幼虾480尾，初始体质量（0.33±0.00）g，随机分为 4 组，每组 3 个重复，每个重复40尾。凡纳滨对虾幼虾随机放入到12个体积为150 L的水槽中进行养殖试验。正式养殖试验共持续42 d。

1.2 试验饲料使用天津通威饲料有限公司生产的对虾配合饲料，以鱼粉、豆粕、花生粕、鱼油、预混料等，加工成硬颗粒饲料，制成基础试验饲料，在此基础上添加 0、250、500、1000 mg/kg 低聚木糖（山东龙力生物有限公司提供，有效成分≥35%）。饲料配方粗蛋白质含量≥42%，粗脂肪含量≥6%，粗灰分含量≤16%。

1.3 试验管理养殖试验于天津恒仟水产养殖车间内进行。试验期间连续充氧，保持溶氧量≥6 mg/L。养殖期间每天分别在 8：30、12：30和17：30进行饱食投喂（连续投喂30 min），并观察凡纳滨对虾的健康状况和摄食情况，记录摄食量。每天早上换水、清理残饵和粪便，每次换水量为50%。饲养试验期间自然光照，盐度18‰~19‰，水温24~28℃，pH 7.8~8.2。

1.4 样品采集养殖试验结束时，禁食24 h，对试验对虾进行计数、称重。每个重复随机挑选20尾对虾用1 mL无菌注射器从围心腔取血，合并置于无菌离心管中，血液采集后静置4 h，10000 r/min离心10 min，取血清分装，置于-80℃冰箱保存，用于后续免疫指标等的测定。

1.5 氨氮胁迫试验养殖试验结束后，每个水槽留取凡纳滨对虾15尾用于氨氮胁迫试验。氨氮胁迫试验每组设置3个重复，每个重复15尾虾。根据Wang等（2003）试验结果，设定的氨氮胁迫试验总氨氮浓度为37 mg/L。胁迫所用试剂为氯化铵，首先配制10 g/L氯化铵母液，然后根据水槽体积加入适量氯化铵母液。水体中氨氮浓度采用纳氏试剂法（Hegazi等，2010）测定，每隔 12 h测定养殖水体氨氮浓度并用氯化铵母液进行调节。胁迫24 h后，采集凡纳滨对虾血清于-80℃保存，用于后续免疫相关指标的测定。

1.6 指标测定

1.6.1 生长性能指标的测定

增重率/（WGR，%）=（Wt-W0）/W0×100；

特定生长率/（SGR，%）=（lnWt-lnW0）/t×100；

成活率/%=Nf/Ni×100；

饲料转化率/%=（Wt-W0）/F×100；

式中：W0为试验开始时虾体重，g；Wt为试验结束时虾体重，g；F为饲料摄入量，g；t为试验天数，d；Nf为终末尾数；Ni为初始尾数。

1.6.2 免疫酶活力的测定试验中免疫酶活力及MDA含量测定采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒。SOD活力测定采用Elstner等（1976）的黄嘌呤氧化酶法。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法（Buege等，1978）。T-AOC活力在酸性条件下抗氧化物质可以还原Fe3+-TPTZ产生蓝色的 Fe2+-TPTZ（Tang 等，2005），在 593 nm处读取吸光度。CAT分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2和钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405 nm处测定其变化量（Aebi，1984）。AKP 和 ACP 分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物。LZM能水解细菌细胞壁上肽聚糖使细菌裂解而浓度降低，透光度增强，故可以根据透光度的变化来推测LZM的含量。PPO能够催化底物酚产生醌，醌在420 nm处有特征性光吸收。

1.7 统计分析试验数据用“平均值±标准误”表示。对胁迫前或胁迫后，不同水平低聚木糖组间数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA），当不同组间有显著差异时，用Duncan法检验进行多重比较；同一组胁迫前后采用t检验方法进行分析，显著水平为0.05，所有数据均使用SPSS 19.0软件进行处理分析。

2 结果

2.1 不同水平低聚木糖对凡纳滨对虾生长性能的影响如表1所示，凡纳滨对虾的成活率为95.85%~100%，不受饲料中低聚木糖水平的影响。随着饲料中低聚木糖水平的升高，凡纳滨对虾的增重率及特定生长率呈现先上升后下降的趋势，均在250 mg/kg组达到最高。饲料转化率在1000 mg/kg组达到最高，但各组间均未达到差异显著水平（P ＞ 0.05）。

表1 不同水平低聚木糖对凡纳滨对虾生长性能及饲料利用的影响%

2.2 不同水平低聚木糖对凡纳滨对虾血清抗氧化能力的影响如图1所示，氨氮胁迫前，超氧化物歧化酶（SOD）随着饲料中低聚木糖水平的升高呈现先升高再下降的趋势，且250 mg/kg组和500 mg/kg组中的SOD显著高于对照组和1000 mg/kg组（P＜0.05），且相对对照组分别升高了109.09%和86.49%。胁迫后SOD也呈现先上升后下降的趋势，250 mg/kg组中的SOD显著高于对照组（P＜0.05），提高了 67.92%。

氨氮胁迫前后，过氧化氢酶（CAT）和总抗氧化能力（T-AOC）均随着饲料中低聚木糖的水平升高呈现先升高后下降的趋势，T-AOC均在500 mg/kg组达到最高，其中胁迫前500 mg/kg组的T-AOC显著高于对照组（P＜0.05），提高了74.30%，胁迫后则未出现显著差异（P＞0.05）。胁迫前250 mg/kg组、500 mg/kg组和1000 mg/kg组CAT显著高于对照组（P＜0.05），分别提升了132.23%、139.19%和110.62%，胁迫后250 mg/kg组和500 mg/kg组 CAT显著高于对照组（P＜0.05），分别提升了37.08%和36.67%。

胁迫前，多酚氧化酶（PPO）呈现先上升后下降的趋势，500 mg/kg组PPO显著高于其他组（P＜0.05），相对对照组提升了147.47%；胁迫后PPO则呈现上升趋势，500 mg/kg组和1000 mg/kg组中PPO显著高于对照组（P＜0.05），分别提升了80.28%和86.39%。

图1 不同水平低聚木糖对胁迫前后凡纳滨对虾血清 SOD、CAT、T-AOC、PPO及MDA含量的影响

胁迫前后，MDA含量随着低聚木糖水平的升高呈现先升后下降的趋势，差异均不显著（P＞0.05）。

2.3 不同水平低聚木糖对凡纳滨对虾血清免疫能力的影响如图2所示，胁迫前ACP和AKP均呈现先上升再下降后上升的趋势，均在250 mg/kg组达到最高，但差异并不显著（P＞0.05）。胁迫后AKP呈现先上升后下降的趋势，在500 mg/kg组达到最高（P＞0.05）；ACP则呈现上升趋势，在1000 mg/kg组达到最高（P ＞ 0.05）。

图2 不同水平低聚木糖对胁迫前后凡纳滨对虾血清AKP、ACP和LZM的影响

胁迫前后，LZM均呈现先上升后下降的趋势，且均在500 mg/kg组达到最高，但组间差异并不显著（P ＞ 0.05）。

3 讨论

3.1 不同水平低聚木糖对凡纳滨对虾生长性能的影响熊沈学（2005）发现，当饲料中低聚木糖水平为0.01%时可明显提高异育银鲫的生长性能（P＜0.05），但当添加水平增加到0.02%时，异育银鲫的增重率与对照组之间未出现显著差异。褚武英等（2008）在草鱼饲养的试验中发现，当低聚木糖添加水平为0.04%时，草鱼增重率显著提高（P＜0.05），但当添加水平为0.06%时则产生了明显的抑制作用。研究结果揭示，过高水平的低聚木糖，可能会抑制肠道内的有益菌活性，导致对虾从肠道吸收的营养物质减少，生长速度相应减慢，从而导致对虾增重率和特定生长率下降（熊沈学，2005；刘栋辉等，2002；Song等，1997；Verlhac 等，1996）。本试验结果表明，增重率和特定生长率均在添加水平较低的250 mg/kg组达到最高（P＞0.05），在添加水平最高的1000 mg/kg组中，增重率和特定生长率低于对照组。饲料转化率与之相反。但在本试验条件下，不同水平低聚木糖并未对增重率、特定生长率和饲料转化率产生显著作用，这可能与试验周期、试验对象大小等有关，需进行进一步研究。

3.2 不同水平低聚木糖对凡纳滨对虾血清抗氧化能力的影响在一个完整的抗氧化体系中，SOD、CAT作为第一道防线和末端氧化酶，二者活力水平是判断机体抗氧化应激能力的重要指标（孙金辉等，2017；胡毅，2007；张学明等，1998）。相关研究表明，饲料中添加适宜水平的低聚木糖能够有效提高奥尼罗非鱼和草鱼等水产动物机体的抗氧化能力（张荣斌等，2011；庞丽娇等，2010）。在本研究中，当饲料中低聚木糖添加水平为250 mg/kg和500 mg/kg时，对虾血清中SOD和CAT活力显著高于其他两组。从抗氧化酶的作用机制来看，适宜水平的低聚木糖能够提升SOD催化分解超氧阴离子以及CAT及时清除组织器官中H2O2的能力，从而减少氧自由基对机体的损害，增强机体抗氧化能力。总抗氧化能力（T-AOC）可以反映出生物体清除氧自由基（ROS）的能力，亦可以较准确的测定出其含量（王一娟等，2011）。本试验中，低聚木糖添加量为500 mg/kg时，T-AOC显著高于对照组。综上，低聚木糖添加水平为250~500mg/kg时能够增强对虾机体的抗氧化能力，但当低聚木糖水平过高时则会对机体抗氧化能力产生一定的抑制作用。

当机体存在大量氧自由基时，细胞氧化损害及脂质过氧化反应随之增多，而脂质过氧化反应的最终产物MDA在一定程度上可以反映细胞损伤程度（陈晓瑛等，2014）。在本试验中，血清中SOD和CAT活力、T-AOC含量与MDA含量呈现出较为明显的负相关性，即对照组以及1000 mg/kg低聚木糖组中对虾血清中MDA含量显著低于其余两组，也间接反映适宜水平的低聚木糖能有效提升机体的抗氧化能力，这与胡晓伟等（2018）对花鲈（Lateolabrax japonicus）的研究结果相一致。

3.3 不同水平低聚木糖对凡纳滨对虾血清免疫力的影响 ACP活性提高，有利于生物体细胞物质代谢，促进生长，提高非特异性免疫力。在酸性条件下，ACP可以通过水解作用，将带有磷酸酯的异物降解（熊沈学，2005）。本试验条件下，饲料中添加不同水平低聚木糖对凡纳滨对虾血清ACP活性有提升作用，但组间差异并不显著。刘岩等（2000）对对虾注射1.0%聚甘露糖醛酸多糖进行免疫刺激发现，肝胰腺ACP活性显著提升。王秀华等（2004）研究表示，对虾饲料中添加肽聚糖可以提高对虾血清中ACP活力。

本试验结果显示，饲料中添加适量水平低聚木糖对凡纳滨对虾血清中AKP活力有一定提升作用，这与吴阳等（2013）对团头鲂及胡晓伟等（2018）对花鲈幼鱼的研究结果类似。上述研究结果显示，低聚木糖对水产动物血清AKP活力有一定提升作用，但均未产生显著作用，且饲料中低聚木糖水平过量可能会产生抑制作用。这可能是由于适量的低聚木糖促进了肠道中有益菌的增殖，进而促进了血清AKP的合成，但过量低聚木糖则抑制了有益菌的繁殖，相应的降低了AKP活力。

LZM可催化糖苷键水解，使细菌细胞壁破裂，细菌死亡，是水产动物体内的重要非特异性防御因子之一，可以体现病原菌以及其他的环境因子对水产动物健康的影响。本试验条件下，饲料中不同水平低聚木糖对凡纳滨对虾血清LZM均有提升作用，其中，以500 mg/kg组LZM活力最高，这与熊沈学（2005）在低聚木糖对异育银鲫血清LZM活力影响的试验中结果类似，何四旺等（2003）在低聚异麦芽糖对罗非鱼血清LZM活力影响的试验中也显示出类似情况。低聚木糖添加水平过高，溶菌酶活力反而下降，可能是由于过量低聚木糖抑制了肠道部分有益菌增殖，而该菌可提高血清溶菌酶活力。

3.4 不同水平低聚木糖对凡纳滨对虾抗氨氮胁迫能力的影响氨氮是指水体中以游离氨（NH3）和铵离子（NH4+）形式存在的氮，其中对水产动物有危害的主要是游离氨。有研究认为，游离氨为亲脂性分子，可以穿过脂质生物膜进入生物体内，对水生动物的表皮细胞造成伤害，从而降低水产动物的免疫力（余瑞兰等，1999）。本研究发现，氨氮胁迫后，凡纳滨对虾血清中SOD活力高于胁迫前，说明短期氨氮胁迫诱导了SOD的表达。有研究发现，短期氨氮胁迫可明显提高中华绒螯蟹、克氏原螯虾以及日本沼虾SOD活力（孔友琴等，2017；芦光宇，2012；Hong 等，2007）。这可能是因为短期氨氮胁迫后，添加低聚木糖会对SOD的表达产生一定的短时刺激兴奋效应（Stebbing，1982），提高SOD活力，从而提高机体应对胁迫的能力。同时，氨氮胁迫并未对凡纳滨对虾血清其他抗氧化酶活力产生明显影响。综上，饲料中添加低聚木糖可提高凡纳滨对虾抗氨氮胁迫能力，但其具体作用机理还需进一步探讨研究。