Box-Behnken响应面分析法优化蛞贝平喘胶囊提取工艺的研究*

沈 安叶晶晶金 湛程 斌

1 浙江省宁波市中医院 浙江 宁波 315010

2 台州恩泽医疗中心（集团）路桥医院 浙江 台州 318050

3 衢州职业技术学院 浙江 衢州 324000

4 浙江医药高等专科学校 浙江 宁波 315100

“蛞贝平喘胶囊”是根据《黎阳王氏秘方》中所载“玉涎丹”开发的制剂，由蛞蝓、浙贝母、蛤蚧、党参等组成，具有补肺益肾、清热化痰、降气平喘之功效，可用于治疗支气管性气喘。其有效成分为贝母素甲、贝母素乙等多种异甾体类生物碱，以及多糖类化合物，为了保证该制剂中有效成分的提取率，笔者采用响应面分析-综合评分法优化其提取工艺，为该制剂的深入研究开发提供实验参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器:Agilent1260型高效液相色谱仪（配蒸发光散射检测器，美国Agilent公司）；UV1902型紫外可见分光光度计（上海奥析科学仪器有限公司）；AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海恒一科技有限公司）；ZN-100型高速中药粉碎机（杭州旭众机械设备有限公司）。

1.2 材料:贝母素甲对照品（HPLC≥98%，批号:110750-201110），贝母素乙对照品（HPLC≥98%，批号:110751-201111)，均购自中国食品药品检定研究院；D-无水葡萄糖（批号:20130910），购自天津市光复精细化工研究所；水为双蒸水，乙腈、甲醇均为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品中贝母甲素、贝母乙素的含量测定：分述如下。

2.1.1 色谱条件:KromasilC18色谱柱（250.0mm×4.6mm，5μm）；柱温:30℃；流动相:乙腈-水-二乙胺（70∶30∶0.03）；检测波长:270nm；流速:1.0ml/min；进流速:2.0L/min[1]。

2.1.2 对照品溶液制备:取贝母素甲和贝母素乙的对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含贝母素甲1.820mg、贝母素乙1.850mg的混合溶液，摇匀，作为混合对照品母液。精密吸取该母液5ml，用甲醇稀释至50ml，得每1ml含贝母素甲0.182mg、贝母素乙0.185mg的混合对照品溶液，备用。

2.1.3 供试品溶液制备:取浸膏0.2g，精密称定，置具塞刻度试管中，精密加入10ml乙醚和0.2ml浓氨试液，密塞，称定重量，超声5min，冷浸24h，加上述混合溶液补足减失的重量。精密量取样品上清液1ml，蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至2ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过膜，即得[2]。

2.1.4 阴性供试品溶液制备:除浙贝母外，分别按处方称取其余药味，提取制成浸膏，余同“2.1.3”项。

2.1.5 空白实验:分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液10μl，进样测定。在确定的色谱条件下，贝母素甲和贝母素乙色谱峰的分离情况较好，其余成分未对测定产生干扰。

2.1.6 线性关系考察:分别精密吸取上述混合对照品溶液1.0ml、3.0ml、5.0ml、7.0ml、9.0ml、10.0ml至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得6个系列浓度的混合对照品溶液。精密吸取上述混合对照品溶液各10μl，进样测定。以浓度C（mg/ml）的对数值为横坐标，以贝母素甲、贝母素乙的平均峰面积的对数值A为纵坐标进行线性回归，得回归方程分别为，lgA甲=1.1601gm甲+2.0079（r=0.9998），lgA乙=1.1467lgm乙+2.0275（r=0.9997），贝母素甲、贝母素乙分别在0.0182mg/ml～0.182mg/ml、0.0185mg/ml～0.185mg/ml范围内线性关系良好。

2.1.7 精密度实验:精密吸取混合对照品溶液10μl，连续进样6次。结果显示，贝母素甲和贝母素乙峰面积的RSD分别为0.69%、0.54%，表明仪器精密度良好。

2.1.8 稳定性实验:精密吸取供试液10μl，于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h内进样测定。结果显示贝母素甲、贝母素乙峰面积的RSD分别为0.76%、0.25%，表明供试品在24h内稳定。

2.1.9 重复性实验:取同一批样品浸膏6份，每份0.2g，精密称定，按“2.1.3”项下制备供试品溶液，分别进样测定。结果显示样品中贝母素甲、贝母素乙含量的RSD分别为1.0%、0.94%，表明方法的重复性良好。

2.1.10 加样回收率实验:取已知含量的样品浸膏9份，每份0.2g，精密加入浓度为0.367mg/ml的混合对照液5.4ml、3.6ml、1.8ml各3份，按“2.1.3”项下制备方法，在“2.1.1”项下色谱条件下进行测定，计算样品中指标成分贝母素甲和贝母素乙的总含量，测得平均加样回收率为94.66%，RSD为3.09%。

2.2 样品中多糖含量测定:分述如下。

2.2.1 对照品溶液制备:取干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，精密称定，置于50ml量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含葡萄糖0.1025mg的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备:精密吸取乙醇提取液2.0ml，置于10ml干燥试管中，再加入5%苯酚水溶液1.0ml，混均，快速加入硫酸6.0ml，混均，冷却后，在490nm波长处测定其吸收度[3]。

2.2.3 线性关系考察:精密吸取对照品溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml，并以第1份为空白对照，以无水葡萄糖含量为横坐标，以吸收度为纵坐标进行线性回归，得方程为A=0.7630m+0.1586(r=0.9943），在0.0205～0.1230mg范围内线性良好（r=0.9981）。

2.2.4 精密度实验:取同一对照品溶液，连续测定吸光度6次，RSD为0.98%，表明仪器的精密度良好。

2.2.5 稳定性实验:取同一供试品溶液，按照上述方法测定0、1、2、3、4、5h内的吸光度，RSD为1.1%，表明供试品溶液在5h内稳定性良好。

2.2.6 重复性实验:取同一批次样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照上述方法分别测定其吸光度，RSD为2.56%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 加样回收率实验:取含有量已知的供试品溶液6份，精密加入同一浓度的对照品溶液，按上述方法测定吸光度，测得平均加样回收率为98.0%，RSD为2.03%。

2.3 单因素实验:分述如下。

2.3.1 乙醇浓度:精密称取处方药材6份，加10倍量30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇，80℃条件下，提取2次，每次2h，计算出膏率，按“2.1.3”项下方法测定贝母素甲、贝母素乙的含量，按“2.2.2”项下方法测定总多糖含量，因方中蛞蝓未收入药典，浙贝母除了药典规定的甾体类生物碱贝母甲素和贝母乙素含量，其有效成分之一多糖也具有独特和显著的药理作用。此外，党参中含有含量丰富的多糖，蛤蚧主要以醇浸出物测定为主。故本实验设定贝母素甲和贝母素乙总量的权重为50%，总多糖权重为30%，出膏率权重为20%。结果表明，各乙醇浓度条件下的综合评分分别为81.27%、83.55%、90.53%、91.37%、94.78%、93.20%，即70%乙醇时最高。因此，选择60%、70%、80%作为乙醇浓度的3个水平。

2.3.2 提取温度:称取处方药材4份，加10倍量70%乙醇，于50℃、60℃、70℃、80℃提取2次，每次2h，计算出膏率，按“2.1.3”项下方法测定贝母素甲、贝母素乙的含量，按“2.2.2”项下方法测定总多糖含量。结果表明不同温度条件下的综合评分分别为90.48%、91.43%、92.35%、92.78%，以80℃条件下评分最高。但是综合评分并没有显著提高，考虑到温度是影响有效成分溶出的重要因素，因此，选择60℃、70℃、80℃作为提取温度的3个水平。

2.3.3 料液比:称取处方药材4份，分别加入6、8、10、12倍量70%乙醇，于80℃提取2次，每次2h，计算出膏率，按“2.1.3”项下方法测定贝母素甲、贝母素乙的含量，按“2.2.2”项下方法测定总多糖含量。结果表明，不同料液比条件下的综合评分分别为89.48%、91.33%、94.56%、93.77%，即10倍量乙醇条件下最高。因此，选择8、10、12倍量70%乙醇作为料液比的3个水平。

2.3.4 提取时间:称取处方药材4份，分别加入10倍量70%乙醇，于80℃提取2次，每次1、2、3、4h，计算出膏率，按“2.1.3”项下方法测定贝母素甲、贝母素乙的含量，按“2.2.2”项下方法测定总多糖含量。结果表明不同提取时间条件下的综合评分分别为88.72%、92.63%、92.88%、93.12%，即在4h条件下评分最高。从生产角度出发，为了节省时间与原来，选取提取2h为最佳提取时间。

2.4 响应面法优化:根据预实验结果，分别提取1、2、3、4次，提取2次时，综合评分有着显著的提升，之后，逐渐趋于平缓，从实际生产角度考虑，故我们选择提取次数为2次。单因素实验表明，提取时间越长综合评分愈高，但提取时间2h后评分变化幅度不大，从实际生产角度考虑，故我们选择提取时间为2h。其余选择影响相对较大的3个因素，即乙醇浓度(X1)、提取温度(X2)和料液比(X3)，以综合评分Y［含出膏率（Y1、%）、贝母甲素和乙素总量（Y2、%）、总多糖提取率（Y3、%）］为评价指标，设定出膏率权重为20%，贝母素甲和贝母素乙总量为50%，总多糖为30%，计算公式为:综合评分Y=（Y1/Y1-max）×Y1权重+（Y2/Y2-max）×Y2权重+（Y3/Y3-max）×Y3权重。分述如下。

2.4.1 模型拟合与方差分析:运用Desing-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken响应面分析，对表中数据进行方差分析及二次多项式回归拟合，得方程为Y=93.626+7.80X1+5.13X2+6.16X3+5.69X1X2+0.68X1X3-0.31X2X3-8.77X12-8.17X22-8.55X32。对回归方程进行方法分析，结果见表1，由表可得各因素中对蛞贝平喘胶囊提取工艺的条件影响程度的大小依次为X1（乙醇浓度）＞X3（料液比）＞X2（提取温度）。

表1 方差分析

图1 提取温度与乙醇浓度的交互作用

图2 料液比与乙醇浓度的交互作用

图3 料液比与提取温度的交互作用

2.4.2 各因素之间的交互作用:运用Desing-Expert 8.0.6软件绘制响应面图以及等高线图，见图1～3。图1显示，当提取温度一定时，随着乙醇浓度的增加，综合评分逐渐上升后缓慢下降；当乙醇浓度一定时，提取温度在60～70℃，综合评分呈上升趋势，后逐渐下降。图2显示，当料液比一定时，在一定范围内综合评分随着乙醇浓度的增加而上升，而后逐渐下降；当乙醇浓度一定时，料液比在8～10g/ml时，综合评分逐渐上升，而后趋于平缓。图3显示，当料液比一定时，提取温度在一定范围内有利于综合评分的升高，但在75～80℃，综合评分逐渐降低。当提取温度一定时，随着料液比的增加，综合评分逐渐上升而后缓慢下降。同时，图1中乙醇浓度与提取温度的交互作用最显著（P＜0.05），响应曲线坡度较陡，等高线呈椭圆形，而且比较密集。

2.4.3 验证性实验:对回归方程取一阶偏导数等于0，解得X1=0.630，X2=0.527，X3=0.376，转换后，得Z1=76.30，Z2=75.27，Z3=10.75，并根据实际情况进行修正，得乙醇浓度为76%，提取温度为75℃，料液比为10.8，综合评分理论预测值为98.59%，实际测定与理论预测基本符合，说明得到的二次回归方程与实际操作拟合良好。

3 讨论

蛞贝平喘胶囊方中蛞蝓祛风定惊，清热解毒；浙贝母清热散结，化痰止咳；蛤蚧补肺益肾，纳气定喘；党参补中益气，和脾胃，除烦渴。蛞蝓含蛋白、多糖类等多种成分，有抗肿瘤、平喘等作用。浙贝母主要成分是贝母甲素以及贝母已素，具有镇咳、祛痰和松弛气管平滑肌、抗炎和逆转细菌耐药等作用。蛤蚧中含有高量的钙、锌、胆固醇以及甘油酯，能够解痉平喘、降低血糖、提高免疫力。党参具有调节血糖、促进造血机能、降压、增强机体免疫力、调节胃收缩及抗溃疡等多种作用。

蛞贝平喘胶囊在提取时，方中浙贝母和党参粉粹，过5号筛，烘干，备用。蛤蚧除去鳞片及头足，切成小块，烘干，粉碎，过5号筛；蛞蝓冷阱温度-85℃冷冻干燥，干燥后低温粉碎，过5号筛；按照响应面设计所优化的工艺条件，以上四味药材，用76%乙醇提取，每次用10.8倍量，提取温度75℃，回流2次，每次2h，提取液滤过，滤液减压浓缩至稠膏，按处方比例称量，用适量的95%乙醇润湿，过80目筛制粒，将制得的湿颗粒于40℃下减压干燥，整粒，加5%滑石粉和0.3%硬脂酸镁为润滑剂，混合均匀，填充，即可。