呼吸道病原体核酸恒温扩增芯片十三联检在下呼吸道感染诊断中的价值

李艳燕 高美丽 赛亚飞 傅恩清

下呼吸道感染是指声门以下的气道感染，根据世界卫生组织2013年发布最新的统计结果,下呼吸道感染位列世界十大死因中的第三位(5.9%)，其导致的严重疾病已经成为全球关注的公共卫生问题[1]。引起下呼吸道感染的病原体主要有细菌、病毒、支原体、衣原体等[2-3]。目前临床病原菌检测主要依靠传统细菌培养和血清学检测相关抗体的方法，但由于操作方法繁琐，获得结果周期较长，每次只能鉴定一种病原体，且阳性检出率低，仅有30%～40%[4]，因此建立一种高效、敏感、快速、准确的病原学检测方法，对临床早期诊断和精准治疗有着至关重要的作用。本研究应用恒温扩增和微流控碟式芯片相结合的技术，对13种常见下呼吸道病原体靶基因进行扩增和检测，并与呼吸道常见病原体分离与培养检出情况进行比较，评价LAMP十三联检在下呼吸道感染中的价值，旨在为临床提供更为快速可靠的实验室诊断依据。

资料和方法

一、一般资料

收集唐都医院呼吸与危重症医学科2018年1月至2018年7月可疑下呼吸道感染患者266例，其中男194例，女72例，年龄15～92岁，平均年龄(61.22±14.66)岁。临床症状主要为发热、咳嗽咳痰，伴或不伴胸痛及呼吸困难，查体呼吸音粗糙伴或不伴干/湿性啰音，胸部X线片或胸部CT扫描等影像学提示下呼吸道感染。

二、检测方法

1. 标本采集： 通过支气管镜检查收集266例下呼吸道痰液，每例样本量不少于0.6 ml，置于相应的无菌样本收集管内立即送检。

2. 仪器和试剂： LAMP十三联检试剂盒及 RTisochipTM恒温扩增微流控芯片核酸分析仪购自博奥生物集团有限公司。呼吸道病原体分离与培养的试剂与材料及全自动微生物鉴定仪(VITEK2-Compact)均购自梅里埃生物公司(法国)。

3. LAMP十三联检： 按试剂盒要求收集、转运、处理及提取基因组DNA核酸，采用恒温扩增、微流控碟式芯片相结合的技术，利用具有链置换功能聚合酶在恒温(65 ℃)条件下进行靶核酸扩增，荧光染料掺入法进行实时荧光检测，应用RTisochip TM恒温扩增微流控芯片核酸分析仪和相应软件进行结果分析，一步完成对13种常见下呼吸道病原菌的检测，包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、结核分枝杆菌复合群、肺炎支原体、肺炎衣原体[5]。

4. 病原体的分离与培养: 将合格的痰标本接种于血平板、加万古霉素巧克力平板、麦康凯琼脂平板，置于35 ℃的5%二氧化碳环境培养24 h或48 h观察培养基，筛选可能致病菌应用法国梅里埃VITEK2-Compact全自动微生物鉴定仪进行鉴定。

三、统计学方法

所有数据均应用SPSS 22.0软件进行处理，计数资料以百分比(%)表示，检出率比较采用相关样本的配对χ2检验，P<0.05为差别有统计学意义，检验结果的一致性分析采用Kappa分析，Kappa>0.4具有一致性。

结 果

一、LAMP十三联检对下呼吸道感染常见病原体基因的检出情况

266例痰标本中，共检测出呼吸道病原体阳性标本为155例，总阳性率为58.27%。单种病原体感染90例(33.83%)，混合感染66例(24.81%)，2种混合感染47例(71.21%)，3种及以上混合感染19例(28.79%)，其中以鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的混合感染为主，大肠埃希菌多为混合感染。155例阳性标本中包含11种呼吸道病原体，其中阳性率鲍曼不动杆菌占21.05%(56/266)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌20.30%(54/266)、铜绿假单胞菌12.03%(32/266)，居于前三位。未检出肺炎衣原体及嗜肺军团菌，见表1。

表1 LAMP十三联检下呼吸道感染患者病原体分布情况[n(%)]

二、痰培养结果

微生物病原体分离培养的257例标本(排除结核感染和肺炎支原体感染)，共92例标本培养阳性，阳性率35.80%。其中鲍曼不动杆菌44株(47.83%)，铜绿假单胞菌23株(25.00%)，肺炎克雷伯菌8株(8.70%)，嗜麦芽窄食单胞菌6株(6.52%)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌6株(6.52%)，大肠埃希菌4株(4.35%)，流感嗜血杆菌1株(1.09%)，肺炎链球菌及金黄色葡萄球菌未培养出。

三、LAMP 十三联检与培养对下呼吸道常见病原体检出情况比较

同时进行LAMP十三联检与微生物病原体分离培养的257例样本(排除结核感染和肺炎支原体感染样本)，LAMP检出病原体阳性标本147例，其总阳性率为57.20%(147/257)；病原体分离培养检出阳性标本共92例，其总阳性率为35.80%(92/257)。两种检测结果的一致性为69.26%(178/257)，阳性符合率为32.08%(68/212)，阴性符合率为82.09%(110/134)，差异有统计学意义(χ2=23.657，P=0.000)。对于鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌，两种方法的检出率相一致，肺炎克雷伯、嗜麦芽窄食单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，两种方法的检出率差异有统计学意义，LAMP十三联检显著高于传统培养法。检出一致性较高的分别为大肠埃希菌(Kappa值0.536)、鲍曼不动杆菌(Kappa值0.637)、铜绿假单胞菌(Kappa值0.717)，见表2。

讨 论

LAMP十三联检技术最先是在2000年由 Notomi 等[6]新开发的一种自动循环的链置换核酸恒温扩增技术。其主要针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，通过链置换DNA聚合酶在65 ℃的恒温条件下完成一系列核酸扩增反应。由于该技术不需要经过模板的热变性、高温变性和低温退火过程，不存在温度变化引起的时间损耗、电泳、紫外观察等过程，整个过程在1 h内即可完成[7-9]，大大缩短了检验周期。本研究采用的呼吸道病原菌核酸检测试剂盒利用恒温扩增芯片技术及高速数字信号处理技术相结合，使检测方法简单快速、试剂耗量低、自动化程度高，提高了检测敏感性，具备了对呼吸道感染性疾病的快速诊断能力[10-13]。国内已有使用该方法检测病原体的相关报道[14-16]，但未见国外的相关报道。

本研究对266例疑似下呼吸道感染患者的痰液样本进行检测，结果表明呼吸道病原体阳性标本155例，总阳性率为58.27%，单种病原体感染90例，混合感染66例，2种混合感染47例，3种及以上混合感染19例，并以铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌混合感染为主。共检出呼吸道病原体11种，其中鲍曼不动杆菌(21.05%)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(20.30%)、铜绿假单胞菌(12.03%)检出率较高，而肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌的检出率均低于10%，且大肠埃希菌不单独存在，多于其他病原体共同存在。本研究中肺炎衣原体、嗜肺军团菌未检出。陈愉生等[17]的研究报道，下呼吸道感染的病原菌主要是铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌和肺炎链球菌。这与本研究结果不同，这可能与我院是省级三甲医院，患者来院就诊之前已经应用抗生素治疗，病原菌已经耐药，因而检出的病原菌大多数是多耐药或泛耐药致病菌有关。

表2 LAMP 十三联检与培养法对各病原体检测的符合率比较

注：“-”肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌培养为阴性，未做统计学分析

LAMP十三联检与培养的257例样本(排除结核感染和肺炎支原体感染样本)病原菌检出情况相比较，病原体分离培养的阳性标本为92例，阳性率为35.80%，LAMP检出病原体阳性标本147例，阳性率为57.20%；LAMP的阳性率显著高于培养的阳性率，差异具有统计学意义。本研究与唐睿珠等[18]研究结果相一致。LAMP十三联检较传统培养法病原体检出率高的原因可能是：①LAMP十三联检是从微量拷贝中获得目的基因，敏感性较高；②传统培养对培养的条件要求高，培养周期较长；③传统培养对培养的技术要求也较高，要求专门的培养基以及专业的技术人员；④部分病原体如流感嗜血杆菌，由于易受用药的影响，使培养阳性率降低。本研究中两种检测方法的结果一致性为69.26%，阳性符合率为32.08%，阴性符合率为82.09%。两种方法的阳性符合率较低，而阴性符合率较高，可能与传统痰液培养法病原体检出率较低有关。

本研究的缺陷是未对LAMP十三联检检出的8例结核分枝杆菌复合群进一步分离与培养统计，无法进一步评价LAMP十三联检在肺结核中的价值。由于本研究检出1例肺炎支原体，未检出嗜肺军团菌、肺炎衣原体，无法进行血清抗体检测，所以无法评价LAMP十三联检在非典型病原体感染中的价值。

综上所述，呼吸道病原体核酸恒温扩增芯片十三联检较传统细菌培养检测更具有高效、快速、敏感、简单及覆盖面广的优点，可为临床诊治提供快捷可靠的实验室依据，对临床早期诊断和精准治疗有着至关重要的作用。