肺炎支原体抗体金标法联合降钙素原、超敏C反应蛋白检测快速诊断支原体肺炎*

涂海霞，韩忠燕，徐丽云，蔡 啸，李 妍

(南京医科大学附属逸夫医院病理与临床检验中心，江苏南京 210000)

肺炎支原体肺炎(MPP)可以发生在所有年龄段，但以儿童和青少年发病率最高。肺炎支原体(MP)感染是儿童社区获得性肺炎(CAP)的重要病原之一，约占儿童CAP 的10%～30%[1-2]。其主要临床表现为发热和咳嗽，缺乏特异性的病征，对于患儿的早期确诊和治疗产生很大的影响[3-4]。部分患儿还会继发出现肺不张、肺纤维化等严重疾病，所以早期诊断MPP以便临床能够及时对患儿做出正确有效的处理至关重要。血清学检测是临床普遍使用的MP抗体检测方法，现通过被动凝集法、金标法、间接免疫荧光法对治疗前血清中的MP-IgM进行检测，比较3种方法的灵敏度、特异度。目前临床上使用的MP快速金标法检测技术应用较为广泛，但由于其较高的漏检率一直无法为临床提供有效精确的诊断。此外，近些年，涌现出很多感染性疾病检测指标，比如降钙素原(PCT)、白介素-6(IL-6)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、C反应蛋白(CRP)等，它们均在MP感染疾病发生时，有直接或者间接的改变[5-8]。本文旨在对以上指标进行检测，通过logistic回归分析和受试者工作特征曲线(ROC曲线)下面积(AUC)计算寻找有效的疾病诊断和预测指标，为临床提供有效帮助。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年9-12月来本院就诊且诊断为MPP的患儿68例作为观察组，所有患儿均符合MPP的诊断标准:发热、咳嗽；胸部X线检查提示双肺点、片状炎性浸润阴影；白细胞大多正常；青霉素类药物治疗无效、大环内酯类药物治疗有效，且间接免疫荧光法测定MP-IgM抗体均为阳性。其中男33例，女35例，年龄0～9岁，平均(3.5±1.9)岁。同时选取同期来本院进行体检的健康儿童63例作为对照组，其中男性35 例，女性28 例；年龄0～8岁，平均(3.9±1.6)岁。两组的年龄进行正态性分析，属非正态分布数据(P<0.05)，再行K-S检验，差异无统计学意义(P=0.236)；性别经Fisher精确检验，两组间比较，差异无统计学意义(P=0.213)，具有可比性。

1.2仪器与试剂 使用Roche E411发光分析仪、Roche Cobas 8000 C701生化分析仪、Sysmex XN-BN3血球仪、德沃CRP分析仪、EUROStar Ⅲ Plus荧光显微镜(德国)。CRP试剂盒：德沃公司试剂；PCT、IL-6、hs-CRP 试剂盒:罗氏诊断公司PCT、IL-6、hs-CRP 试剂；WBC试剂盒：希森美康公司试剂；MP-IgM抗体检测试剂盒：日本赛乐迪亚-麦可Ⅱ MP-IgM抗体检测试剂盒(被动凝集法)、丽珠MP-IgM抗体检测试剂盒(金标法)、德国欧蒙呼吸道病原体谱抗体IgM检测试剂盒(间接免疫荧光法)。

1.3方法

1.3.1标本采集及处理 使用阳普黄色干燥管采集静脉血2 mL，3 000 r/min 离心5 min分离血清，立刻-80 ℃冻存，用于测定血清的IL-6、hs-CRP、PCT水平；使用阳普紫色EDTA-K2抗凝管采集静脉血500 μL，直接测定血常规和CRP。

1.3.2指标检测 使用Roche E411发光分析仪检测PCT、IL-6；使用Roche Cobas 8000 C701生化分析仪检测hs-CRP；使用Sysmex XN-BN3血球仪检测血常规；使用德沃CRP分析仪检测CRP；使用赛乐迪亚-麦可Ⅱ测试剂盒、丽珠检测试剂盒、德国欧蒙呼吸道病原体谱检测试剂盒血清MP-IgM；所有步骤按照试剂盒说明书进行操作。

1.4统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，对数据进行正态性检验，年龄、PCT、IL-6、hs-CRP、CRP数据属于非正态分布，以中位数(四分位数间距)[M(P25,P75)]表示，组间比较采用两独立样本非参数检验方法K-S检验进行统计分析，灵敏度、特异度使用McNemar′s-Test。正态分布指标WBC进行t检验观察差异，定性指标性别和金标结果进行Fisher精确检验统计分析。行逐步logistic回归分析得到预测概率新变量并作ROC曲线，获得曲线下面积(AUC)等诊断效能参数。评价MP抗体金标法和PCT、IL-6、hs-CRP、CRP、WBC单项和联合检测对MPP的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.13种方法灵敏度、特异度比较 3种MP-IgM检测方法结果比较分析显示，被动凝集法的灵敏度、特异度分别为80.9%、79.4%；金标法分别为77.9%、88.9%；间接免疫法分别为98.7%、88.9%。经NcNemar′s-Test分析，金标法和间接免疫荧光法相比，特异度的差异无统计学意义(P>0.05)，灵敏度差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3种检测方法灵敏度、特异度比较(%)

注：与金标法比较，*P<0.05

2.2两组血清MP抗体、IL-6、hs-CRP、PCT及全血WBC和CRP检测结果比较 将观察组与对照组血清或全血中IL-6、hs-CRP、PCT、WBC和CRP进行K-S检验，其中IL-6、hs-CRP、PCT、CRP呈非正态分布(P<0.05)，WBC呈正态分布(P>0.05)，非正态分布数据再进行K-S检验，正态分布数据进行t检验，定性结果进行Fisher精确检验，结果显示，MP抗体、IL-6、hs-CRP、PCT及CRP差异具有统计学意义(P<0.05)，WBC差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3逐步logistic回归分析各变量 以MP抗体(金标法)、IL-6、hs-CRP、PCT和CRP的检测结果为检验变量，疾病与否为状态变量，用向前法作logistic 回归，所有指标均与疾病密切相关(P<0.05)，对各指标进行筛选，剔除IL-6、CRP指标，保留MP(金标法)、PCT、hs-CRP建立了logistic回归模型，并分析产生联合预测变量1：MP(金标法)+ PCT和联合预测变量2：MP(金标法)+ PCT+ hs-CRP两种预测变量，对回归模型进行似然比检验，与单项检测相比，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 两组血清MP抗体、IL-6、hs-CRP、PCT及全血WBC和CRP检测结果比较

表3 逐步logistic回归分析各变量

2.4各指标单独检测、联合检测逐步logistic回归分析预测变量的ROC曲线分析 以hs-CRP、PCT、金标法、金标法+PCT、金标法+PCT+hs-CRP 为检验变量，诊断结果为状态变量，作ROC 曲线分析，结果显示，hs-CRP、PCT、金标法单独诊断MPP的曲线下面积(AUC)分别为0.809(95%CI：0.731～0.872)、0.989(95%CI：0.953～0.999)、0.834(95%CI：0.759～0.893)，均有一定的诊断价值(P<0.05)。其中PCT的诊断效能最大，灵敏度和特异度分别达到94.1%和96.8%，hs-CRP和金标法的特异度达到了90.5%和88.9%，但是灵敏度分别仅为70.6%和77.9%，效能略差。金标法+PCT联合诊断MPP的AUC为0.996(95%CI：0.994～1.000)，灵敏度95.6%,特异度98.4%；而金标法+PCT+hs-CRP联合诊断MPP的AUC为0.998(95%CI：0.994～1.000)，灵敏度97.1%,特异度98.4%；两种联合预测变量没有统计学差异(P>0.05)，见表4、图1。

表4 hs-CRP、PCT、金标法和预测变量金标法+PCT、金标法+PCT+hs-CRP 对MPP的预测效能分析

图1 各指标单独及联合检测的ROC曲线

3 讨 论

MP属于柔膜体纲支原体科支原体属，是有能力在体外不依靠活细胞生存并能自我复制的最小微生物之一，其特点是缺乏肽聚糖细胞壁、具有和宿主相互作用的丝状尖端结构[9-10]。研究表明MP是引起社区获得性呼吸道感染的主要病原体之一，可引起支气管炎和非典型肺炎[11]。MPP治疗时常规的青霉素类抗菌药物治疗是无效的，且疗程长，通常需要2～3周。如不早期诊断，更会延误病情，并发肺不张、肺纤维化等严重并发症，此外还会出现肺外并发症，如脑炎等[12]。MP感染的临床症状和体征缺乏特异性，给临床诊断带来一定困难，实验室早期、快速、明确检测MP感染对临床尽早、合理用药至关重要。

目前MP检测主要依靠支原体培养、血清学检测、分子检测等等手段。支原体培养作为MP检测的金标准[9]，因其耗时长且阳性率低导致其在MP早期检测中应用严重受限；而近期流行的分子检测，由于仪器操作设备要求高、操作繁琐也一直未被广泛使用[13]；所以在临床应用较多的仍然是血清学检测，一方面因为MP感染时，潜伏期为2～3周，当患者出现症状而就诊时，IgM抗体已达到相当高的水平，因此，IgM抗体阳性可作为急性期感染的诊断指标[13]；另一方面，血清学检测具有快速简便的操作优势。

目前，MP的血清学检测有3种方法，分别是被动凝集法、金标法、间接免疫荧光法。3种方法中，间接免疫荧光法有最高的灵敏度和特异度，被动凝集法最低且操作较为复杂；金标法的灵敏度稍低，为77.9%，而特异度和间接免疫荧光法一致，为88.9%，且检测快速，仅需20 min即可判读结果，快速诊断潜在价值较高。

IL-6被证实可通过受体与糖蛋白130(gp130)激活Janus激酶-信号转导子与转录激活子(JAK-STAT)、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)等信号通路在炎症和免疫调节中发挥重要的生物学效应[14-16]；血清PCT是降钙素前肽物质，在CAP中明显升高，且与疾病的发展呈现一定的相关性[17]；而CRP和hs-CRP也一直被认为是感染时会明显升高的急性时相反应蛋白[7]。但是由于巨大的个体差异和方法学的限制，仅仅通过单独的检测指标对MPP诊断有一定的局限性，并导致一定的误诊和漏诊，而联合检测可能在一定程度上能弥补这一不足。

本研究在证实MPP组与对照组在金标法阳性率和IL-6、PCT、CRP、hs-CRP水平存在明显差异的基础上，运用logistic回归对以上所有指标包括WBC进行逐步筛选，虽然观察组IL-6水平显著高于对照组，但是其与CRP和WBC在模型计算中被剔除了，而金标法、PCT和hs-CRP被保留了，而且通过ROC曲线分析，三者联合诊断的AUC达到了0.998。

需要指出的是：(1)WBC虽被模型剔除，但是在MPP中，其阴性的指示意义是较大的，因为该指标在排除细菌性肺炎时有一定的价值；(2)虽然IL-6是公认的炎症因子且观察组IL-6水平显著上升，其25%分位和75%分位值分别是6.17 pg/mL 和22.56 pg/mL，但其诊断效能不如PCT，即在MP诊断时，同时选择IL-6和PCT是没有必要的，应优先选择PCT；(3)hs-CRP虽然被模型保留，但其与金标法和PCT联合较金标法与PCT联合并未发生显著差异，提示hs-CRP对模型有较好的修正意义，但是可能由于样本量过少，导致差异并无统计学意义；(4)CRP被剔除，说明CRP在MP的诊断中的意义并不是太大，临床中并非必查指标，如果一定要查，应考虑选择hs-CRP；(5)被保留的三项指标金标法、PCT和hs-CRP的全部检测出报告时间可以压缩在1 h内，大大提高了诊断效率；(6)联合检测后，联合指标的灵敏度和特异度由之前金标法单用时的77.9%、88.9%提高至95%以上，升高显著。

4 结 论

综上所述，MP抗体金标法联合PCT和hs-CRP检测对MP感染的诊断效能显著提高，且检测时间明显缩短，有较大的临床经济性和实用性。此外，联合检测在本研究中无假阳性，但仍需在大样本研究中进一步评价其假阳性率，而在临床工作中，结合影像等结果以及临床经验进行具体分析和考虑，也有望进一步提高MPP的诊断准确性。