白花蛇舌草对A549肺癌干细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

曾 珠，何成诗，孙剑峰，刘 磊，杨秀丽，肖 玮

(1.成都中医药大学临床医学院,成都 610075;2.成都中医药大学附属医院呼吸科，成都 610072)

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，随着环境污染及社会、经济等因素的影响，肺癌的发病率和病死率逐年升高。国家癌症中心2018年发布的数据显示，我国男性肺癌发病率及病死率均排名第一，我国女性肺癌发病率排名第二，病死率排名第一[1]。目前国内外研究表明，对于肺癌的治疗依然首选手术，但对大多数患者来说就诊时已属于中晚期肺癌，失去了手术机会，而放、化疗已成为其治疗中不可或缺的重要手段，但其对人体毒副作用大，长期使用降低肿瘤细胞对其敏感性的缺点限制了临床疗效。中药具有减轻放、化疗毒副作用，改善肿瘤细胞耐药性，增强抗肿瘤作用的重要特点[2]。白花蛇舌草为茜草科植物的全草，现代研究发现白花蛇舌草在体内外均有抗肿瘤作用，其主要作用机制包括抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，增强免疫功能，抑制侵袭和肿瘤细胞的多耐药性等。本实验通过研究白花蛇舌草作用于A549肺癌干细胞，探讨其对肺癌干细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，进一步阐明其抗肿瘤可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株人肺癌A549细胞系购于上海中国科学院细胞库。

1.1.2主要试剂与仪器 白花蛇舌草(成都中医药大学附属医院中药房)；DMEM培养、胎牛血清(美国Gibco公司)；青霉素-链霉素溶液100×(碧云天公司)；CD133抗体(美国RD公司)；CCK-8试剂盒(美国Sigma公司)；Annexin V-PE/7-AAD流式试剂盒(美国BD公司)；一抗Anti Sox2、Anti Oct4(兔来源，美国Abcam公司)；Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit(美国BD公司)；低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；倒置显微镜、照相系统(日本Olympus公司)；流式细胞检测仪(美国BD公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将人肺癌A549细胞培养于含10%优质胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基中，2～3 d换液1次，细胞80%融合度时传代，可按照1∶3传代比例进行，于37 ℃ 5% CO2及饱和湿度培养箱中培养。

1.2.2A549肺癌干细胞诱导 取对数生长期的A549细胞，以1×103个/mL的密度接种到6孔板中，用无血清干细胞培养基(DMEM培养基+4 U/L胰岛素+1X B27+20 ng/mL EGF+20 ng/mL bFGF)悬浮培养，隔1～2 d更换培养基，2～3周后可见肿瘤细胞球形成，传代用于后续实验。

1.2.3流式细胞检测CD133表达 取对数生长期的A549细胞，接种到6孔板中，待细胞生长达到60%～70%用0.25%胰酶消化细胞，离心后用PBS重悬细胞，在每个流式检测管或板式微孔中加入50 μL的稀释后的抗体(抗体用Staining Buffer稀释成合适的浓度)。在空白管/孔中加入50 μL Staining Buffer，在各管/孔中分别加入50 μL细胞悬液，常温孵育30 min后加入Staining Buffer(每个流式检测管中加2 mL，而每微孔中加200 μL)，离心后重复洗涤3次，100 μL重悬细胞后上流式仪检测[3-6]。

1.2.4免疫组织化学检测Sox2、Oct4表达 将细胞消化后，用完全培养基重悬调整细胞密度至2×104个/mL，取细胞悬液滴在无菌的12孔板中铺上的细胞爬片上，30 min后在培养皿中补加完全培养液放于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养，用PBS漂洗2次后用4%多聚甲醛固定，再分别经0.5%Triton X-100处理(室温)60 min、3% H2O2处理(室温)15 min，处理前后均用PBS洗涤3次。山羊血清室温封闭60 min，取出甩干封闭液(不漂洗)，一抗孵育(稀释比1∶200)4 ℃过夜，阴性对照用PBS液代替一抗，PBS清洗标本3次各5 min，二抗(生物素标记)工作液孵育37 ℃ 30 min，PBS清洗标本3次各5 min，碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液(湿盒)37 ℃ 30 min，PBS清洗标本3次各5 min，DAB显色(避光，镜下观察至棕色)，再用苏木素复染，自来水洗返蓝，梯度乙醇脱水后封片至镜下观察[7-8]。

1.2.5CCK-8检测细胞增殖 取正常生长的A549细胞，调整细胞浓度至1×105个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL，每组细胞设9个复孔，将96孔板移入培养箱中培养(37 ℃ 5% CO2)，培养24 h后实验组按白花蛇舌草提取物0.5 g/mL加入细胞中，分别培养24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要产生气泡)，于培养箱内孵育1～4 h，同时设置空白孔(培养基、CCK-8)、对照孔(未经处理的细胞、培养基、CCK-8)，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值(A值)[9]。细胞活力(%)=[A(实验组)-A(空白组)]/[A(对照组)-A(空白组)]×100%，细胞抑制率(%)=[A(对照组)-A(实验组)]/A(对照组)×100%。

1.2.6流式细胞检测细胞凋亡和周期 将A549细胞用6孔板培养，待细胞生长达到60%～70%，对照组加入DMEM培养基，实验组加入白花蛇舌草提取物1 g/mL，胰酶消化收集细胞，用 PBS洗涤细胞2次。在50 μL的Binding Buffer中加入5 μL 7-AAD染液混匀，室温、避光并反应5～15 min后再加入450 μL的Binding Buffer混匀，加入1 μL AnnexinV-PE混匀室温、避光、反应5～15 min，1 h内进行流式细胞仪的观察和检测。用70%乙醇4 ℃固定2 h或更长时间。检测前 PBS冲洗细胞 1次，加入0.5 mL碘化丙啶染色液，37 ℃避光温浴30 min。随后4 ℃或冰浴避光存放，24 h内用流式细胞仪在激发488 nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。

2 结 果

2.1细胞中CD133表达情况 A549肺癌干细胞中CD133阳性率(70.483 30±0.092 92)%，A549细胞中仅为(5.056 70±0.185 83)%，经传代培养后诱导形成的细胞球富含肺癌干细胞。

2.2细胞中Sox2、Oct4表达情况 通过免疫组织化学检测出Sox2、Oct4表达在A549细胞及A549肺癌干细胞中均呈阳性，主要在细胞质中表达，在A549肺癌干细胞中染色强度更强，见图1～3。在视野为200倍的高倍镜下选取10个视野求平均阳性细胞率，Sox2在A549细胞及A549肺癌干细胞中的阳性细胞率分别为63.33%、86.67%，Oct4阳性细胞率分别74.30%、84.30%，差异均有统计学意义(P<0.01)。

A：A549细胞(×200)；B：A549细胞(×400)；C：A549肺癌干细胞(×200)；D：A549肺癌干细胞(×400)

图1 DAB免疫组织化学染色检测Sox2表达

A：A549细胞(×200)；B：A549细胞(×400)；C：A549肺癌干细胞(×200)；D：A549肺癌干细胞(×400)

图2 DAB免疫组织化学染色检测Oct4表达

A:×200;B:×400

图3 阴性对照免疫组织化学检测

2.3白花蛇舌草对A549肺癌干细胞增殖的影响 空白组各时间点A值差异无统计学意义(P>0.05)，其余两组在不同时间点A值差异有统计学意义(P<0.05)，实验组A值较对照组低(P<0.05)，见表1。白花蛇舌草作用于肺癌干细胞24、48、72 h对细胞增殖的抑制力分别为9.88%、19.35%、26.20%，随着时间的延长细胞的活力越来越低，细胞的抑制率越来越高。

表1 各组不同时间段A值

2.4白花蛇舌草对A549肺癌干细胞凋亡的影响 经白花蛇舌草干预后细胞凋亡率为(27.903 30±0.405 26)%，对照组细胞凋亡率为(5.063 30±0.150 11)%，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.5白花蛇舌草对A549肺癌干细胞细胞分裂周期的影响 经白花蛇舌草干预后处于G1期的细胞数明显增多，S期的细胞数明显减少，细胞分裂停滞于G1期，见表3。

表2 两组细胞凋亡率比较

表3 两组细胞周期分布

3 讨 论

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类生命健康，其发病的分子机制尚未完全明确。肺癌干细胞是来源于肺癌组织中可被特异性标志物标记，具有多向分化、自我更新、无限增殖等生物学特征的异质性细胞群，其与肺癌的侵袭、复发转移、耐药等恶性生物学特征密切相关[10]。肿瘤干细胞多呈静息状态，不仅能逃脱针对此细胞增殖的损伤，而且凭借其较强的修复能力，能对已造成的损伤进行最大程度的修复。肺癌干细胞表面转运蛋白能将化疗药物转运至胞外，降低细胞内药物浓度以减轻化疗产生的影响[11-12]。随着对肺癌研究的不断深入，越来越多的证据表明肺癌的复发、转移及其对放、化疗的耐受等生物学特性均与肺癌干细胞有关。中医因思路独道，治疗方案个体化，化学结构特殊而具有作用多靶点、疗效确切及不良反应轻等特点，近年来成为肺癌干细胞研究领域的新方向。

在古代中医并没有肺癌的病名，可归入“肺积”“肺壅”“肺疽”“肺痈”“痞癖”“咳嗽”“咯血”等范畴。肺癌的病性属于本虚标实，基本病因病机属于正虚邪毒，与痰浊聚肺、情志失调、烟毒内蕴等有关。正气亏虚，脏腑气血阴阳失调，成为肺癌发病的基础。一方面肺为娇脏，邪气从外而入，邪毒内蕴，导致肺失宣降，肺气闭郁，气滞血瘀，日久积块；另一方面津液输布不利，积聚成痰，痰阻脉络，血行不畅，痰瘀互结，从而形成肿块[13]。有研究表明，在肺癌发生、发展的某些阶段，热毒是肺癌的主要致病因素之一，热邪稽留，蒸灼津液，炼液为痰，痰阻经络，气血运行不畅，热、痰、瘀互结，形成热毒，阻塞脏腑经络形成癌肿，临床表现为发热、疼痛、局部灼热、肿块增大等症状，治疗应以清热解毒为主[14]。

白花蛇舌草属于清热解毒类中药，微苦、甘、寒。归胃、大肠、小肠经，具有清热解毒、利湿通淋等功效，临床上多应用于痈肿疮毒、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、热淋涩痛、湿热黄疸等症[15]。有研究表明[16]，其主要化学成分有蒽醌类、环烯醚萜苷类、黄酮类、三萜类、甾醇类、香豆素类、烷烃等，能增强免疫活性、抗氧化和抗肿瘤活性。

本研究结果显示，经白花蛇舌草干预后的A549肺癌干细胞培养24、48、72 h后细胞的增殖力明显受到抑制，细胞凋亡率增加，其细胞周期处于G1期的细胞数大幅度增加，处于S期的细胞数明显减少，表明白花蛇舌草能促进细胞凋亡，阻滞肺癌干细胞的细胞周期。与普通体细胞相比，机体成体干细胞的细胞周期多处于G1期，当机体组织受到损伤或刺激时，干细胞可由静息期进入增殖、分化期，通过完成细胞的增殖和分化以修复机体。肝癌干细胞也具备这个特点，处于G1期的细胞具有较强的增殖和分化潜能。白花蛇舌草的干预明显减少了A549肺癌干细胞G1期细胞的数量，从而抑制了恶性细胞的增殖和分化能力。

综上所述，肺癌干细胞是肿瘤细胞增殖、分化及自我更新的母细胞，白花蛇舌草能有效地抑制肺癌干细胞的增殖，促进肺癌干细胞凋亡，阻滞肺癌干细胞的细胞周期，从而达到治疗肺癌的目的，但其具体的作用机制还有待进一步研究。