七氟醚对大鼠海马组织NR2B、Caspase-3的影响*

朱彦东,刘 钰

(1.南方医科大学深圳医院麻醉科，广东深圳 518101；2.浙江省东阳市红十字会医院 322100)

随着麻醉药物在临床的广泛使用，人们开始关注全身麻醉药对脑发育的影响。近年来有研究显示，异氟烷等全身麻醉药会导致神经细胞的凋亡，具有一定的神经毒性[1-2]。目前，发育期动物中枢神经系统成为研究热点，但是对于麻醉药导致神经细胞退化和凋亡的具体机制仍未十分明确。N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA受体)是离子型谷氨酸受体的1个亚型，在神经系统发育过程中发挥重要的作用。研究显示，N-甲基-D-天冬氨酸-2B受体(NR2B)不仅介导突触的强化及神经元的存活，还可介导细胞凋亡[3]。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,其中Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，在细胞凋亡中起着不可替代的作用[4]。本研究探讨七氟醚对大鼠海马组织NR2B、Caspase-3的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选取SD大鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)60只，7 d龄，雌雄各半，饲养环境为12 h明暗循环，温度20～22 ℃，湿度55%～60%，大鼠断奶前配乳母鼠喂养，自由取食。将大鼠分为对照组和麻醉组，每组再分为3个时间点，即麻醉前、麻醉后24 h及麻醉后7周，每组10只。

1.2方法

1.2.1麻醉方法 大鼠放入麻醉箱，对照组开启30%空氧混合气；麻醉组开启七氟醚(浓度2.5%)和30%空氧混合气，麻醉时间4 h。

1.2.2Western blot 分别于麻醉前、麻醉后24 h及麻醉后7周取大鼠海马组织，收集蛋白样品使用细胞裂解液，BCA 蛋白定量法检测各组蛋白浓度。NR2B用10%分离胶，冷却到室温，把蛋白样品直接上样到十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳加样孔内，每孔上样量30 μg，打开电泳仪，上层胶时使用80 V电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用120 V电压恒压电泳。恒流 0.22 mA 湿转120 min，转膜完毕后漂洗，5%脱脂奶粉室温封闭 1 h。参考一抗说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗，4 ℃过夜。洗涤，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1 h。漂洗后进行化学发光，根据一抗的不同，选择合适的曝光时间显影并保存图像。

1.2.3Morris水迷宫测试 Morris水迷宫检测麻醉后7周大鼠的空间学习记忆能力。大鼠Water Maze水迷宫为上海欣软信息科技有限公司生产，由圆形水池、图像自动采集和处理系统组成。Morris水迷宫测试包括定位航行实验(place navigation)和空间搜索实验(spatial probe test)，实验训练阶段连续进行3 d，每天训练4次。观察和记录大鼠寻找并爬上平台的路线图及所需时间，记录为潜伏期。

2 结 果

2.1两组海马组织NR2B蛋白表达情况 麻醉前及麻醉后7周，麻醉组和对照组大鼠海马组织NR2B蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；麻醉后24 h，麻醉组大鼠海马组织NR2B蛋白表达明显高于对照组及麻醉前(P<0.05)，见图1。

图1 两组海马组织NR2B蛋白表达变化

图2 两组大鼠海马组织Caspase-3蛋白表达

表1 各组Morris水迷宫测试情况

2.2两组海马组织Caspase-3蛋白表达情况 麻醉前及麻醉后7周，麻醉组和对照组大鼠海马组织Caspase-3蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；麻醉后24 h，麻醉组大鼠海马组织Caspase-3蛋白表达明显高于对照组及麻醉前(P<0.05)，见图2。

2.3两组大鼠Morris水迷宫测试情况 将麻醉后7周大鼠进行Morris水迷宫测试，麻醉组大鼠第1、3天游泳潜伏期、总路程明显高于对照组(P<0.05)。麻醉组和对照组游泳速度比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

3 讨 论

目前针对全身麻醉药物对中枢神经系统影响的报道较多。研究显示，麻醉药会导致神经细胞的凋亡，对发育期动物中枢神经系统具有不可逆转的损害[5]。闵娜等[6]将发育高峰期的大鼠暴露在异氟醚中超过5 h，发现大鼠的神经细胞发生广泛的退化和死亡。七氟醚为临床上常用的吸入麻醉药，广泛应用于儿童手术，随着越来越多地应用在临床，其对神经、心脏系统的不良反应也受到研究者的关注。之前已有许多关于七氟醚对神经结构和神经认知功能的影响的报道。谢思宁等[7]研究报道，七氟醚对幼鼠发育期中枢神经系统具有损害作用。CIECHANOWICZ等[8]将怀孕大鼠长期暴露超剂量的异氟醚中，发现幼鼠中枢神经系统神经发生延迟，但其具体作用机制目前尚未明确。

NMDA受体在中枢神经系统，尤其在大脑皮层和海马广泛分布。海马体(Hippocampus)是位于脑颞叶内的一个部位，主要负责长时记忆的存储转换和定向等功能[9]。NMDA 受体具有不同的亚型，与学习、记忆等多种神经功能密切相关。研究显示，NMDA 受体参与诱导细胞的存活和凋亡，在神经元细胞的坏死、凋亡和抗凋亡过程中发挥重要作用[10]。NR2B亚基主要表达于发育早期阶段，对NMDA受体的功能起着重要作用。因此本研究选择NR2B 为大鼠发育期的监测指标。Caspase家族与细胞凋亡密切相关，引发的级联反应是细胞凋亡过程的中心环节[11-12]。Caspase-3在死亡受体介导的细胞凋亡途径中起关键作用[13]。本研究结果显示，麻醉后24 h，麻醉组大鼠海马组织NR2B蛋白和Caspase-3蛋白表达明显高于对照组及麻醉前(P<0.05)；麻醉前及麻醉后7周，麻醉组和对照组大鼠海马组织NR2B蛋白和Caspase-3蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。七氟醚麻醉对幼鼠海马组织NR2B、Caspase-3蛋白表达影响较大，说明七氟醚麻醉对小鼠认知功能影响的机制与海马组织NR2B、Caspase-3蛋白表达有关，但具体的影响机制目前尚不明确，其长期效应有待进一步研究。

Morris水迷宫测试可很好地反映大鼠海马的功能，是研究空间学习记忆的标准实验，广泛应用于神经生物学领域研究[14]。Morris水迷宫测试通过在水中设置隐藏平台，记录实验动物寻找平台所用时间和所走路径，判断动物的记忆功能，研究与空间学习记忆相关的脑区功能评价。本研究中，麻醉组大鼠第1、3天游泳潜伏期、总路程明显高于对照组(P<0.05)，游泳速度比较差异无统计学意义(P>0.05)。因此笔者认为，大鼠接受2.5%七氟醚麻醉4 h会造成海马功能长期损害，影响记忆功能，这与王权等[15]研究结果一致。2.5%七氟醚对大鼠的运动能力无明显损害。七氟醚可能通过作用于NMDA受体，引起行为异常和学习、记忆功能障碍的发生，具体的机制仍需要进一步研究。

综上所述，七氟醚麻醉可即刻造成幼鼠海马组织NR2B、Caspase-3蛋白表达升高，成年海马功能长期损害，影响记忆功能。但成年后海马组织NR2B、Caspase-3蛋白表达无明显异常，值得进一步研究。