大株红景天注射液维持心肌缺氧/复氧损伤的线粒体形态和功能的相关研究

王渊博，朱镕湃，田心

缺血性心脏病已成为全球范围中主要威胁人类健康疾病之一[1]。研究发现，线粒体结构和功能的改变对心血管病程起到重要作用[2]。线粒体是细胞能量代谢的重要组成，线粒体功能障碍可诱导心肌细胞凋亡及坏死[3]。近年来很多研究报道显示大株红景天注射液对冠心病的治疗具有良好的效果[4-7]。本实验旨在细胞水平阐明大株红景天注射液对缺氧复氧心肌细胞线粒体损伤的保护机制，为临床应用提供基础实验证据。

1 材料与方法

1.1 材料H9C2（2-1）心肌细胞系购自中科院上海生命科学研究院。细胞培养液、胎牛血清购自美国Corning公司，JC-1试剂盒、兔抗GAPDH、兔抗p-Drp1、Drp1抗体购自美国abcam公司；mPTP试剂盒购自上海贝博生物公司；MitoTracker-Red荧光探针购自碧云天公司；流式细胞仪为美国BD Immunocytometry Systems产品；电泳系统及凝胶成像系统均为Bio Rad公司产品；大株红景天注射液购自通化玉圣有限公司（国药准字Z20060361）。

1.2 方法

1.2.1 H9C2（2-1）心肌细胞的培养及缺氧复氧模型的建立细胞培养液配备10%胎牛血清的高糖培养基，当细胞生长至互相接近时，胰酶消化传代，实验前1 d，更换为低浓度胎牛血清的培养基，诱导其分化向心肌细胞。缺氧时将细胞于注满氮气的缺氧小室中，放置37℃孵箱内孵育6 h后更换正常培养液，于普通孵箱内复氧2 h即为缺氧复氧模型的建立。

1.2.2 试验分组及给药心肌细胞分为对照组、对照加大株红景天组、缺氧复氧组、缺氧复氧加大株红景天组。参照已有研究[8]，考虑药物效果和浓度呈一定正相关，选用10 ml/L浓度的大株红景天注射液在复氧即刻给药。对照组及模型组给予等体积PBS干预。

1.2.3 心肌细胞线粒体膜电位的检测将细胞缺氧、复氧操作同上，给药处理后，将培养皿中的细胞消化下来，于离心管中用无菌PBS液洗涤后，按照JC-1试剂盒操作，加入染色工作液，避光反应30 min后，沉淀细胞移至流式专用管中，经流式细胞仪分析检测。

1.2.4 心肌细胞线粒体通透孔的检测缺氧复氧及给药处理完毕后，重悬细胞于离心管中，按照mPTP试剂盒操作，加入钙黄绿素工作液染线粒体及胞浆，加入氯化钴工作液，因其不能进入线粒体结合胞浆的钙黄绿素使其淬灭，其线粒体的荧光强度可反应mPTP开放程度，避光反应15 min，沉淀细胞移至流式专用管中，经流式细胞仪分析检测。

1.2.5 线粒体裂解形态的观察将细胞铺于激光共聚焦皿中，处理完毕后，将MitoTracker-Red工作液加入培养基进行线粒体染色，室温孵育30 min后用激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体形态。

1.2.6 免疫印迹（Western blot）法检测p-Drp1的表达各组处理完毕后提取心肌细胞蛋白，凝胶电泳后将其转膜到硝酸纤维素（NC）膜上，快速封闭液室温封闭10 min后，滴加1:600的抗p-Drp1和Drp1一抗孵育过夜，TBST洗膜后再用1:5000二抗室温孵育1 h，再次TBST洗膜，滴加显影液进入发光仪器后曝光，获取图像后进行分析获取统计数据。

1.2.7 统计学方法实验结果以均数±标准差（x±s）表示，SPSS 19.0统计软件处理后，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大株红景天注射液能够稳定缺氧/复氧心肌细胞线粒体膜电位水平与对照组比较，缺氧复氧组线粒体膜电位明显下降（P＜0.01）；与缺氧复氧组比较，缺氧复氧加大株红景天组线粒体膜电位明显上升（P＜0.01）（图1、表1）。

2.2 大株红景天注射液能够减少缺氧/复氧心肌细胞线粒体通透孔开放缺氧复氧情况下，线粒体通透孔异常开放率增加，正常运转的通透孔比率下降（P＜0.01）；给予大株红景天注射液后，正常活性的通透孔比率上升（P＜0.01）（图2、表2）。

图1 线粒体膜电位的流式细胞检测结果

表1 大株红景天注射液对心肌细胞线粒体膜电位影响的分析（x±s）

2.3 大株红景天注射液能够减少缺氧/复氧心肌细胞线粒体裂解常氧状态及加入大株红景天药物后，线粒体大部分呈网管状结构；而予以缺氧复氧造模后，线粒体网管状结构消失，成点状分布；模型组给予大株红景天药物干预后，融合状态的网管状线粒体形态增多（图3）。

2.4 大株红景天注射液能够抑制缺氧/复氧心肌细胞p-Drp1的表达提取细胞蛋白用免疫印迹法分析发现，缺氧复氧后细胞内p-Drp1表达明显升高（P＜0.01）；给予大株红景天注射液后，其表达较缺氧复氧组明显下降（P＜0.01）（图4、表3）。

3 讨论

图2 线粒体通透孔流式检测结果

表2 大株红景天注射液对心肌细胞线粒体通透孔影响的分析（x±s）

图3 激光共聚焦显微镜下观察各组线粒体分裂状态

图4 大株红景天注射液对心肌细胞p-Drp1表达

表3 大株红景天注射液对心肌细胞p-Drp1表达分析（x±s）

心肌细胞缺氧时，进入无氧代谢状态，产生乳酸，胞内PH下降，钠钙交换增加，使胞内Ca2+超载，ATP耗竭及磷酸盐增加，再灌注时，pH的恢复引发线粒体电子传递链重新激活，活性氧簇大量产生，导致线粒体膜电位下降、线粒体膜通透孔开放，细胞色素C等凋亡蛋白释放，启动相关凋亡程序产生心肌损伤[9]。常氧状态细胞中，线粒体膜电位的存在对于生成ATP而为机体供能有重要作用[10]，线粒体膜电位下降引发三羧酸腺苷合成障碍，抑制氧化磷酸化反应[11]。在缺氧复氧状态下，再灌注15 min内行药物干预有保护线粒体膜通透孔和稳定线粒体膜电位的作用[12,13]。可更好模拟临床给药疗效，本实验也选用再灌注即刻给药。检测线粒体通透孔开放可观察细胞凋亡启动程序是否被激活，检测线粒体膜电位可间接了解线粒体功能代谢水平，两者反映了线粒体的功能状态。

活细胞的线粒体处于动态，形态和尺寸都在发生改变，近年来才为人们熟知，分裂和融合控制着线粒体的运动[14]。而在分裂过程中，最为主导的是Drp1蛋白。细胞死亡过程中线粒体大范围碎片化，Drp1参与此过程，抑制Drp1表达可抑制细胞坏死[15]。观察线粒体裂解和检测p-Drp1表达反映了线粒体形态的动态变化过程。

合理使用中药防治心血管疾病已成为替代医学研究的热点，大株红景天为景天科红景天属多年生草本植物，现代药理研究表明其具有抗缺氧、抗衰老、抗肿瘤等作用[16-18]。我们从线粒体形态和功能角度阐述了在缺氧复氧心肌细胞受损情况下，给予大株红景天注射液可使p-Drp1表达减少，减少线粒体裂解，升高线粒体膜电位，减少线粒体膜通透性，抑制心肌细胞坏死，证实其保护细胞线粒体损伤的作用。

综上所述，大株红景天注射液可减轻心肌细胞线粒体由缺氧复氧引起的损伤，保护其形态和功能，但是其如何发挥作用的具体上下游通路仍需进一步研究。