基于网络药理学的虎杖治疗结直肠癌作用机制研究

严卿莹 叶晔 冯冠 郭凯波 阮善明 沈敏鹤

摘要：目的  基于网络药理学方法分析虎杖治疗结直肠癌的药理机制，为新药研发提供参考。方法  通过TTD、Dis数据库提取结直肠癌的主要靶点，从TCMSP数据库中提取虎杖的主要化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30、药物半衰期（HL）≥4 h、类药性（DL）≥0.18筛选活性成分，通过HIT、ChemMapper、STITCH数据库提取活性成分主要靶点，采用Cytoscape3.2.1软件构建成分-靶点网络，并分析主要通路。结果  经筛选，共获得9种主要活性成分，作用于56个靶点，其中核心靶点有ESR1、KRAS、TYMS、AKT1、PPARD、PTGS1、FNTB、PTGS2、PPARG、ALDH2、PDE5A等，主要作用于调控生长因子及其受体信号通路、白细胞介素介导的信号通路、细胞凋亡及生物氧化等多种信号通路。结论  本研究初步揭示了虎杖治疗结直肠癌的多成分、多靶点、多通路的作用机制，可为虎杖开发利用提供参考。

关键词：网络药理学;虎杖;结直肠癌;活性成分

中图分类号：R285;R273.53    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）04-0096-05

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，随着饮食结构及生活习惯的改变，我国结直肠癌发病率呈上升趋势，在恶性肿瘤中发病率和病死率均分别居第4位和第5位[1]。

虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. Et Zucc.的干燥根茎，性微寒，味微苦，有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛功效，其化学成分主要有蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类等。虎杖具有抗炎、抗病毒、抗菌、调血脂、抗血栓、改变血流变、扩张血管、抗氧化、抗肿瘤等作用[2]。研究表明，虎杖及其主要化学成分白藜芦醇在结直肠癌的治疗中发挥重要作用[3]。复方研究中，白藜芦醇含量高的虎杖发挥着主导作用[4]。柏连松临床治疗结直肠癌以虎杖作为常用药，疗效显著[5]。虎杖成分较多，抗结直肠癌的主要机制尚未明确。本研究主要筛选结直肠癌的潜在治疗靶点，通过网络药理学方法对虎杖的主要活性成分进行筛选，分析活性成分的作用靶点及生物通路，从而阐明虎杖治疗结直肠癌可能的作用机制。

1  资料与方法

1.1  结直肠癌靶点预测

以“colorectal cancer”为关键词，挖掘TTD数据库（https：//db.idrblab.org/ttd/）及Dis数据库（http：// www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）中治疗结直肠癌的潜在靶点。在Dis数据库中，得分越高，表明该靶点与疾病的相关性越高。设定得分>0.01的目标靶点为结直肠癌的潜在靶点。删除2个数据库间的重复靶点。为标准化靶点基因信息，将不同ID类型转换为Swiss-Prot号。

1.2  化学成分收集与活性成分筛选

在TCMSP数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp. php）查找虎杖相关的分子信息及相应的生物学测试，在此基础上以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、药物半衰期（half-life，HL）≥4 h、类药性（drug likeness，DL）≥0.18作为活性成分筛选条件。

1.3  目标靶点收集

已验证的靶点从HIT数据库（http：//lifecenter.sgst. cn/hit/）中提取，根据Pubchem数据库（https：//pubchem. ncbi.nlm.nih.gov）中各活性成分的分子结构图，从ChemMapper（http：//lilab.ecust.edu.cn/chemmapper/）、STITCH数据库（http：//stitch.embl.de/）中获得潜在的预测靶点。ChemMapper在线工具基于3D相似性预测靶点，本研究设定各活性成分的靶点预测参数为分子的3D相似性>0.85，且均来源于DrugBank数据库。

1.4  网络构建与分析

使用Cytoscape3.2.1软件构建成分-靶点网络。使用插件CentiScape分析网络以计算拓扑参数，包括自由度、介数。自由度越大，参与的生物功能越多，生物学重要性越强;介数越大，表明节点在网络中越重要。

1.5  通路分析

通过Cytoscape插件，Reactome FI软件进一步分析虎杖治療结直肠癌预测靶点的相关通路。将相关靶点导入Reactome FI，设定P≤0.01，错误发现率（false discovery rate，FDR）≤0.01进行通路分析。

2  结果

2.1  结直肠癌相关靶点基因

从TTD数据库共获得31个靶点基因，从Dis数据库中获得2753个潜在靶点基因（其中得分>0.01的有124个靶点），删除重复基因，共获得150个可能与结直肠癌相关的靶点基因。

2.2  虎杖化学成分及目标靶点

从TCMSP数据库中提取虎杖化学成分63种，经筛选，获得9种主要活性成分：木犀草素、槲皮素、β-谷甾醇、大黄素甲醚苷、大黄酸、Torachrysone- 8-O-beta-D-（6'-oxayl）-glucoside、6，8-Dihydroxy-7-methoxyxanthone、囊毒碱及鸭脚树叶碱，见表1。

2.3  活性成分验证靶点及预测靶点

各活性成分的目标靶点见表2。其中HZ-1包含56个已验证靶点和357个预测靶点，HZ-2包含167个已验证靶点和564个预测靶点，HZ-3包含10个已验证靶点和1018个预测靶点。

2.4  活性成分-靶點网络分析及主要活性成分

构建9种活性成分成分-靶点网络，该网络由65个节点构成，包括9个成分节点和56个目标靶点，见图1。

网络分析表明，β-谷甾醇自由度为36，介数为0.435 28，预测为虎杖治疗肿瘤中发挥的主要成分，其次为木犀草素（自由度为31、介数为0.435 28）、大黄酸（自由度为22、介数为0.108 20），见表3。

ESR1为9种活性成分共有的目标靶点，因此我们认为ESR1是虎杖治疗结直肠癌的最主要靶点，KRAS、TYMS、AKT1、PPARD、PTGS1、FNTB、PTGS2、PPARG、ALDH2、PDE5A亦为相对重要靶点，见表4。

2.5  基因功能及通路分析

应用Reactome FI对虎杖治疗结直肠癌相关靶点进行信号通路分析，根据设定，共富集到38条信号通路。相关靶点主要富集于免疫系统中的细胞因子信号、通用转录途径、白细胞介素介导的信号通路、PI3K/AKT信号通路、B细胞受体介导的信号通路、EGFR信号通路、ERBB信号通路、TP53信号通路，同时与细胞凋亡、生物氧化、调节胰岛素样生长因子、P21的转录激活等密切相关，见表5。

3  讨论

结直肠癌属中医学“癥瘕”“肠蕈”“积聚”等范畴，起病较为隐匿。目前化疗仍为大部分转移性结直肠癌的首选，尽管靶向药物在一定程度上提高了客观缓解率和总生存率，但多药耐药及不良反应影响了疗效及患者生存质量。因此，中医药干预结直肠癌相关研究越来越受到重视。

本研究通过网络药理学方法初步筛选出虎杖治疗结直肠癌的活性成分为β-谷甾醇、木犀草素和大黄酸。β-谷甾醇是存在于植物和蔬菜中的主要生物活性成分，可清除活性氧诱导结直肠癌细胞凋亡，发挥抗氧化性，从而抑制结直肠癌的发生发展[6]。木犀草素是一种天然黄酮类化合物，可抑制CREB1的转录，从而阻断上皮间质转化，发挥抗结直肠癌的作用[7]。大黄酸作为虎杖的重要成分，能逆转卵巢癌中阿霉素多药耐药[8]，还可减轻恶病质[9]。因此，虎杖治疗结直肠癌主要通过β-谷甾醇、木犀草素和大黄酸发挥作用。

ESR1是结直肠癌发生、进展和转移中最重要的调节基因[10]，同时KRAS、TP53等可能在结直肠癌诊断中起关键作用[11]。KRAS突变、p53缺失可能是结肠癌转移的潜在生物标志物[12]。本研究结果表明，虎杖治疗结直肠癌的靶点主要集中在ERS1，而KRAS亦为重要靶点之一，尽管目前EGFR抗体对RAS野生型结直肠癌显示出较好的疗效，但不能使KRAS突变型患者获益[13]，故以虎杖为主药的中药制剂及复方可能在一定程度上提高KRAS突变患者的疗效。

虎杖主要成分大黄酸可通过MAPK、PI3K/AKT、ERK等多条信号通路发挥抑制肿瘤细胞活化、增殖、侵袭和迁移的作用[14]。本研究结果显示，虎杖治疗结直肠癌的相关靶点主要富集于调控生长因子及其受体，包括EGFR信号通路、ERBB信号通路、PI3K/AKT信号通路、TP53信号通路。通过对活性成分的靶点预测，筛选出虎杖治疗结直肠癌的主要靶点还有TYMS、AKT1、PPARD、PTGS1、FNTB、PTGS2、PPARG、ALDH2、PDE5A等基因，表明虎杖可通过多靶点、多通路发挥治疗结直肠癌的作用。

本研究初步探讨了虎杖治疗结直肠癌的药理机制，但虎杖活性成分较多，在肿瘤治疗中发挥重要作用的许多成分如白藜芦醇因OB、HL及DL未达到要求，未进一步分析。因此，本研究结果仍需要进一步实验验证。

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（收稿日期：2018-07-28）

（修回日期：2018-08-16;編辑：向宇雁）