超高效液相色谱-串联质谱技术分析人体血浆中硫酸吲哚酚及硫酸对甲酚含量

2019-04-25肖永华革丽亚万严建黄常刚

分析科学学报 2019年2期

肖永华*，革丽亚，朱庆，毛翔，万严建，黄常刚

(武汉市疾病预防控制中心，湖北武汉 430022)

硫酸吲哚酚(IS)和硫酸对甲酚(p-CS)分别为络氨酸和色氨酸在肠道细菌作用下的代谢产物，肠道厌氧菌将食物中的酪氨酸转变为4-羟基苯乙酸，4-羟基苯乙酸脱羧为对甲酚，大部分对甲酚经肠道黏膜吸收，在肠道上皮细胞磺基转移酶的作用下转化为p-CS；食物中的色氨酸经大肠埃希菌分解产生吲哚，吲哚经门静脉进入肝脏经羟化、硫酸化，最终生成IS[1 - 2]。当人体肾功能出现障碍时，p-CS和IS不能被有效的排除体外，从而导致在体内蓄积。有研究表明，p-CS和IS具有肾脏毒性和心血管毒性，能促进心肌细胞凋亡，加重动脉钙化使动脉壁变厚以及心室肥大[3 - 6]；p-CS和IS还能促进肾间质细胞向成纤维细胞转化，引起肾脏的纤维化，属尿毒症毒素[7 - 9]。目前，我国慢性肾病的发病率高达11%，发病率和血液透析人数呈逐年上升趋势[10]。在慢性肾病患者的队列研究中，游离p-CS被发现是慢性肾病患者的一个重要的死亡率预测因子[11]。因而监测血液透析患者中p-CS和IS含量具有十分重要的临床意义。

检测p-CS和IS的方法主要有高效液相色谱-荧光法[12 - 13]以及高效液相色谱-串联质谱法[14]。相比于前者，高效液相色谱-串联质谱法灵敏度更高，定性更准确。本文采用乙腈沉淀血清白蛋白，离心后将上清液用超纯水稀释，建立超高效液相色谱-串联质谱法检测肾病血液透析患者血浆中p-CS和IS含量。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UPLC-TQD超高效液相色谱-串联质谱仪(美国，Waters公司)，配备电喷雾离子源(ESI)以及Masslynx4.1数据处理系统；AL204电子天平(瑞士，Mettler Toledo公司)；IKA涡旋振荡器(德国，IKA公司)；TGL-16B高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。

硫酸吲哚酚(IS)、硫酸吲哚酚-d4(IS-d4)购自Sigma公司，硫酸对甲酚(p-CS)、硫酸对甲酚-d7(p-CS-d7)购自Toronto公司。IS和p-CS分别用乙腈配制成100 μg/mL标准储备液，IS-d4、p-CS-d7分别用乙腈配制成1.0 μg/mL标准储备液，-18 ℃避光保存。乙腈、甲醇(色谱纯，美国天地公司)，乙酸铵(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。实验用水为Milli-Q纯水机(德国默克密理博公司)制备。

1.2 样品处理

选择某医院血液透析中心23名血液透析患者作为监测对象(监测对象均签署知情同意书)，分别于血液透析前和血液透析后，抽取监测对象的血液于不加抗凝剂的采血管中，高速离心后将上层血浆取出于-18 ℃ 保存，分析前将血浆取出恢复至室温后，吸取100 μL血浆于1.5 mL EP离心管中，加入200 μL 1.0 μg/mL内标和700 μL乙腈，涡旋1 min后，用高速离心机以10 000 r/min离心5 min，再吸取100 μL上清液，加入900 μL超纯水，涡旋混匀后测定。

1.3 仪器条件

色谱条件：Waters UPLC®HSS T3色谱柱(100×2.1 mm，1.8 μm；美国Waters公司)；流动相A为5 mmol/L 乙酸铵溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0～1.5 min，95%A；1.5～3.0 min,95%～5%A；3.0～4.5 min,5%A；4.5～5.0 min,5%～95%A。流速：0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，负离子模式；毛细管电压：-2.3 kV；脱溶剂气温度：350 ℃；离子源温度：120 ℃；扫描模式：多反应监测(MRM)。通过质谱直接进样的方式优化IS和p-CS质谱参数，MRM采集参数详见表1。

表1 p -CS和IS的MRM参数

*:quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 样品提取条件优化

p-CS和IS在人体内与血清白蛋白的结合率达到了90%以上，均结合在血清白蛋白Ⅱ区，通过静电作用力与血清白蛋白非共价结合[15 - 16]。当血清被加热、稀释、加入强电解质溶液或加入有机相使血清白蛋白产生沉淀时，p-CS和IS与血清白蛋白的非共价结合被破坏，p-CS和IS由结合态转化为游离态[17]。在纯乙腈介质中p-CS和IS的色谱峰较宽且有分叉现象，随着介质中水相比例的增加色谱峰峰宽逐渐变窄，本文选取先用乙腈沉淀血清蛋白，离心后上清液用水稀释10倍后检测，即样品溶剂为水∶乙腈(9∶1，V/V)。

2.2 流动相的选择

以甲醇-水作为流动相时，p-CS和IS色谱峰有重叠现象，不能很好的分离，将水更换为5mmol/L乙酸铵溶液时，p-CS和IS分离度有所改善，达到实验要求，因而本文选取甲醇-5mmol/L乙酸铵溶液作为分析p-CS和IS的流动相，p-CS、p-CS-d7、IS和IS-d4的MRM色谱图见图1。

图1 p -CS、p -CS-d7、IS和IS-d4的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of p -CS,p -CS-d7,IS and IS-d4

2.3 方法学考察

2.3.1线性关系及检出限将100 μg/mLp-CS和IS混合标准溶液用水稀释，配制浓度分别为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/Lp-CS和IS混合标准系列，内标p-CS-d7和IS-d4的浓度均为20 μg/L，制作标准曲线，p-CS回归方程为：Y=26.83X+19.66，相关系数r=0.9993;IS回归方程为：Y=7.74X+5.72，相关系数r=0.9997。以3倍信噪比计算方法的检出限，IS和p-CS的仪器检出限分别为0.5 μg/L和0.1 μg/L。

2.3.2回收率和精密度准确吸取100 μL血浆样品，分别加入1.0、5.0、10 μg/mLp-CS和IS混合标准溶液，按1.2方法处理样品，计算加标回收率，分析结果见表2。

2.4 样品分析

在上述实验条件下，分析了23位监测对象血液透析前和血液透析后的血浆中p-CS和IS的浓度水平，p-CS结果见图2，IS结果见图3。

表2 血浆中p -CS和IS加标回收率及精密度(n=6)

图2 23位血液透析患者p -CS含量Fig.2 Content of p -CS in 23 hemodialysis patients

图3 23位血液透析患者IS含量Fig.3 Content of IS in 23 hemodialysis patients

血液透析患者透析前p-CS和IS浓度分别为1.47～204.69 μg/mL、5.31～62.97 μg/mL，透析后p-CS 和IS浓度分别为1.41～107.91 μg/mL、2.04～48.3 μg/mL。通过透析血浆中p-CS和IS浓度均有所降低，其中p-CS降低了4.08%～58.5%，IS降低了5.39%～63.0%。从图2、图3可以看出，高浓度的p-CS和IS通过血液透析后降低的比例并不比低浓度p-CS和IS降低的比例高，通过血液透析降低的比例跟p-CS和IS的浓度不呈线性相关。同时通过自身配对t检验对血液透析前后p-CS和IS的浓度进行统计分析，结果均显示P<0.01，说明血液透析前后p-CS和IS的浓度有显著性差异。由此可见，通过血液透析可有效降低血液透析患者血浆中p-CS和IS浓度。