香豆素基甲醛荧光探针的合成及其性能研究

李和平， 陈忠晓， 秦鑫鑫， 江 升， 赵 超, 肖 青

(1.道路结构与材料交通行业重点实验室，长沙理工大学化学与生物工程学院,湖南长沙 410114; 2.云南水利水电职业学院基础教育部,云南昆明 650499)

甲醛(FA)是一种重要的工业原料,它广泛应用于制造业、食品防腐和药物合成等领域,因其与DNA和蛋白质具有非常强大的结合力,长期暴露于甲醛环境中会导致记忆力衰退和各种神经性疾病[1]。但现代研究发现,在组蛋白去甲基化或DNA甲基化过程中，以及甲胺和多胺的降解过程中，生物系统中可能产生内源性甲醛[2]，但它在体内发挥何种生理功能尚不可知，因此，开发可检测甲醛的有效成像剂有利于研究内源性甲醛的生理功能。目前检测甲醛的主要方法有比色法、电化学法、荧光分光光度法、高效液相色谱法和红外光谱法[3]。相比其他几种方法,荧光分光光度法具有灵敏度高、操作方便、重现性好、实时检测等特点,但是由于现在所用到的成像剂大多含有萘环[4 - 5]、二酮类[6]对人体有毒化合物,因此开发生物系统背景下检测甲醛的优秀分子工具,在临床诊断方面具有重要意义。

香豆素广泛存在于芸香科、豆科、茄科等天然植物和微生物代谢产物中,在荧光分析、染料、生物医药等领域都有着极其广泛的应用[7]，而且作为一种天然产物，不仅对人体无毒，且具有抗病毒、抗癌等生理功能,特别是在抗HIV活性、抑制癌细胞生长和诱导凋亡方面表现出优秀的药理特性[8]，以香豆素类衍生物为荧光团的荧光探针具有荧光量子产率高,Stokes位移大,光稳定性高等优点[9 - 10]。因此，最近几年香豆素类衍生物应用于有机荧光染料的研究得到了广泛的重视。

本文基于光诱导电子转移(PET)机理,将肼与4-甲基-7-羟基-8-甲酰基香豆素相结合,引入甲腙基作为荧光猝灭基团和甲醛识别基团,得到了一种检测甲醛的新型荧光探针4-甲基-7-羟基-8-甲酰基香豆素(CNH)，为研究内源性甲醛的生理功能提供有效的分子工具。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

Aglient 1100 series 液相色谱/质谱仪(美国，安捷伦公司);Varian Mecury(300 MHz)核磁共振仪(美国，VARIAN公司);JY02S型紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司);MCR-3型微波化学反应器(上海标和仪器有限公司);Avatar-360红外光谱仪(美国，Nicolet);U-4100紫外光谱仪(日本，日立公司);SGWX-4显微熔点测定仪(上海精密科学仪器有限公司);F-7000荧光光谱仪(日本，日立公司)。

实验所用试剂均为市售分析纯或化学纯，无需进一步处理。实验用水为去离子水。

1.2 实验方法

1.2.14-甲基-7-羟基香豆素(MC)的合成参考文献方法[11]合成并有所改进,主要改进的是采用H3PO4(85%)作为催化剂。

1.2.24-甲基-7-羟基-8-甲酰基香豆素(MFC)的合成取4-甲基-7-羟基香豆素10.2470 g(0.058 mol),六亚甲基四氨(HMTA)19.8292 g(0.142 mol),置于500 mL的圆底烧瓶中.加入100 mL的冰HAc,温度90 ℃下水浴回流5 h后,微波10 min(90 ℃);自然冷却至室温后加入150 mL 20%HCl,70 ℃下继续水浴回流1 h,再微波10 min(70 ℃);自然冷却后倒入500 mL冰水混合物中充分搅拌1 h,析出大量的黄色固体;用200 mL×1,100 mL×2的乙酸乙酯萃取，合并萃取液后,无水Na2SO4干燥;旋转蒸发至剩余少量液体后,过滤(相当于进行一次重结晶),真空干燥得淡黄色产物1.5163 g,产率12.80%。

m.p.:179～181 ℃;IR(KBr):3 428.86 cm-1(-OH),1 723.63 cm-1(-CO),1 607.69 cm-1(-CHO),1 594 cm-1(-C=C);1H NMR(300 MHz,DMSO-d6):δ:2.43(s,3H,C4-CH3),6.32(s,1H,C3-H),6.93(d,1H,C6-H,J=8.9 Hz),7.93～7.97(d,1H,C5-H,J=8.9 Hz),10.46(s,1H,CHO),11.90(s,1H,OH);MS:m/z204.1(M+),分子式C11H8O4,计算值204.0。

1.2.3探针CNH的合成在50 mL的圆底烧瓶中,加入MFC 0.8932 g(4.38 mmol),20 mL的乙醇,5 mL 的水合肼,于70 ℃下水浴回流4.5 h,旋转蒸发至剩余少量溶液,过滤,水洗2次,乙醇洗一次,真空干燥得泛黄白色固体0.8020 g,产率为83.97%。

1H NMR(300 MHz,DMSO-d6):δ:2.40(s,3H,C4-CH3),6.21(s,1H,C3-H),6.86～6.88(d,1H,C6-H,J=8.9 Hz),7.36(s,2H,-NH2),7.56(d,1H,C5-H,J=8.9 Hz),8.42(s,1H,-CH=N-),12.79(s,1H,OH);MS：m/z218.1(M+),分子式C11H10N2O3,计算值218.1。

1.2.4CNH-甲醛的合成在50 mL的圆底烧瓶中,加入探针CNH 0.3027 g(1.316 mmol),2 mL甲醛(≥37%),18 mL去离子水，室温下搅拌10 min,过滤,水洗,真空干燥,得泛黄白色固体0.2510 g,产率为76.80%。

MS：m/z230.1(M+),分子式C12H10N2O3,计算值230.1。

1.3 溶液的配制

室温下,将探针CNH和化合物CNH-甲醛，分别溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,加入磷酸盐缓冲溶液(PBS)，配制成1 mmol/L的储备液(pH=7.4)。实验所用到的甲醛、氨基酸等其它分析物均先溶于DMSO,再加入PBS，配制成1 mmol/L的储备溶液(pH=7.4)。实验时所需不同浓度的溶液均以PBS(pH=7.4)稀释得到。

1.4 荧光光谱测定

1.4.1探针对甲醛的响应性在10 mL 30 μmol/L CNH的PBS(pH=7.4)中,加入0～200 μmol/L的甲醛溶液,在相同的实验条件下,振荡后静置1 min,测定荧光光谱。

1.4.2探针对甲醛的响应时间在相同的实验条件下,测定30 μmol/L CNH的PBS(pH=7.4)的荧光光谱,然后立即加入等物质的量的甲醛溶液,持续扫描10 min,测量时间响应曲线。

1.4.3探针的选择性取不同的分析物各1 mmol/L,加入30 μmol/L CNH的PBS(pH=7.4),静置1 0 min后,在相同的实验条件下测量荧光光谱,随后在三色紫外灯下进行比色测定。

2 结果与讨论

2.1 探针CNH的设计与合成

基于光诱导电子转移(PET)[4]机理,设计合成了新型荧光探针CNH。探针CNH的合成路线如图1所示。

图1 CNH合成路线及其检测甲醛的机理Fig.1 Synthesis of probe CNH and the mechanism of the “off-on” detection for formaldehyde(FA)

很多文献对4-甲基-7-羟基香豆素的合成早已有报道,常用的方法有Perkin反应和Pechmann反应[11]。本文采用简单易行的Pechmann合成法构建4-甲基-7-羟基香豆素荧光团,实验以H3PO4(85%)为反应催化剂,避免了强酸的加入,利用廉价易得的间苯二酚与乙酰乙酸乙酯，在室温条件下反应得到MC,继而采用Duff反应[12]将其8号位甲酰基化,整个实验原料易得，条件温和,副反应少,均采取重结晶的方式提纯目标产物,省去了硅胶色谱柱纯化,操作简单。探针CNH对甲醛的识别机理是在由于探针CNH的-NH2的给电子作用，光诱导电子转移受阻,荧光猝灭，与甲醛作用后生成-N=CH2而荧光恢复[4]。

2.2 甲醛浓度对探针CNH荧光强度的影响

图2 甲醛浓度(0～400 μmol/L)对CNH(5 μmol/L)荧光强度的影响Fig.2 Effect of FA concentrations on the probe CNH(5 μmol/L) fluorescence intensities in PBS buffer 25 ℃，pH=7.4,1%DMSO，λex=325 nm.

基于本研究是以检测内源性甲醛为目标，因此选定血液(pH=7.4)和室温作为研究的固定条件，下述研究都在此基础上进行。为了测定探针CNH对甲醛的敏感性,向探针CNH溶液中加入不同浓度甲醛，立即测定其荧光光谱,如图2所示。由图2可知，随着甲醛浓度的升高(0～400 μmol/L),探针CNH溶液的荧光强度不断增大,当甲醛浓度达到100 μmol/L,探针溶液的荧光强度几乎不变。取甲醛浓度0～100 μmol/L，λem=450 nm的荧光强度数据进行作图，并线性拟合,得到(Imin-I)/(Imin-Imax)对甲醛浓度的对数lgc的线性回归曲线方程为:y=0.9523x+4.7652，相关系数R2=0.9876,由此计算得探针CNH对甲醛的检测限为1.0×10-5mol/L。

2.3 探针CNH对甲醛的响应时间研究

为了测定探针CNH对FA的响应时间，将等物质的量的探针CNH与甲醛溶液混合，测定不同时间后的荧光强度,如图3所示。由图3可知，探针CNH与甲醛的反应在室温下约400 s即可完成，说明探针CNH对甲醛具有反应快速的优点。

2.4 探针CNH对甲醛的选择性研究

探针的专一性选择是评价其性能的重要因素。为了研究探针对甲醛的选择特异性,采用荧光光谱测定探针CNH对其它分析物的响应性，如图4所示。由图4可知，探针CNH与甲醛溶液混合后,显示出了更强的荧光信号,表明探针对甲醛具有高度的特异性。用三色紫外灯(波长365 nm)照射探针CNH与甲醛等不同分析物混合后的溶液，发现探针CNH与甲醛的混合溶液发微弱的光,而探针CNH与CuSO4、丙酮等其它物质混合后的溶液发出亮光，探针CNH对甲醛在紫外灯下具有独特的颜色显示，通过裸眼即可快速比色检测，为实现对环境中甲醛的实时监测提供便利。

图3 CNH(5 μmol/L)荧光强度在有(A)和无(B)甲醛(5 μmol/L)时随时间变化曲线Fig.3 Reaction-time profiles of the probe CNH(5 μmol/L) in the presence(A) and absence(B) of FA(5 μmol/L) in PBS buffer 25 ℃，pH=7.4,1%DMSO，λex/λem=325/450 nm.

图4 探针CNH(10 μmol/L)在各种分析物存在时的荧光强度Fig.4 Fluorescence intensity of probe CNH(10 μmol/L) in the presence of various analyte in 20 mmol/L PBS buffer(pH=7.4) 1%DMSO,λex/λem=325/450 nm.1:free CNH;2:H2O2;3:CuSO4;4:CaCl2;5:FA;6:CH3CHO;7:C6H5CHO;8:glycine;9:acetone.

3 结论

以香豆素衍生物为荧光团,构建合成了一种新型的检测甲醛的荧光探针(CNH)。该荧光探针CNH对甲醛具有高的选择性和灵敏度、低检测限和响应快等优点,而且与现有的检测甲醛的探针相比，探针CNH以天然香豆素结构为母核，本身无毒性，可作为研究内源性甲醛的生理功能的荧光探针。而且，在紫外光照射下,通过比色可实现裸眼识别，为环境部门快速有效监测甲醛提供了有效的分子工具,在甲醛检测领域具有广阔的应用前景。