冠心病患者血清miR-34a和HIF-1α水平与冠状动脉侧支循环形成的相关性研究

仉慧颖,耿 威

(大庆油田总医院：1.无创检查科；2.消化内科，黑龙江大庆 163316)

冠心病是由于冠状动脉功能性改变或器质性病变引起的冠状动脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损害，是一种常见的心血管疾病，严重威胁人们身体健康，半个世纪以来发病率不断增加[1]，主要表现为心绞痛、心律失常、心力衰竭[2]。冠状动脉侧支循环形成一般在冠状动脉高度狭窄之后，有助于改善心肌供血不足的状况[3]。研究表明，微小RNA-34a(miR-34a)与血管形成密切相关[4]。缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是缺氧情况下诱导生成的转录因子，有研究表明，其与血管生成密切相关[5]，且HIF-1α是miR-34a的靶基因之一[6]。因此本研究通过观察miR-34a、HIF-1α在冠状动脉侧支循环患者血清中表达差异，探讨血管miR-34a、HIF-1α表达水平与冠心病患者冠状动脉侧支循环的相关性，以期为冠心病的治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年6月至2018年9月本院收治的98例冠心病患者为冠心病组。纳入标准：符合冠心病诊断标准[7]；经冠状动脉造影检查存在右冠状动脉单支、左前降支、左回旋支血管狭窄，狭窄程度大于或等于90%。排除标准：入院24 h内死亡；合并冠状动脉心肌桥、急性心肌梗死、恶性肿瘤；经皮冠状动脉介入治疗；多脏器受损、脑血管疾病。根据Rentrop分级系统评估，冠状动脉侧支循环程度将患者分为侧支形成组和侧支未形成组。Rentrops分级：0级代表无侧支循环；1级为分支动脉充盈，但主要的心外膜动脉未充盈；2级为心外膜动脉出现且只有部分充盈；3级为心外膜动脉出现且完全被充盈[8]。2、3级患者为侧支形成组共52例，其中男24例，女28例，年龄42～78岁，平均(56.28±9.12)岁。0、1级患者为侧支未形成组共46例，其中男22例，女24例，年龄44～79岁，平均(57.94±7.94)岁。另选取同期体检健康者58例作为对照组，男30例，女28例，年龄43～80岁，平均(58.12±8.64)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过医院伦理委员会批准，所有研究对象均知情同意。

1.2方法

1.2.1血液采集 冠心病患者入院12 h内，健康对照组于晨起空腹采取静脉血5 mL置于EP管内，-4 ℃，3 000 r/min离心20 min，小心吸取上清液置于另一个EP管内，-80 ℃冰箱保存，避免多次冻融。

1.2.2qRT-PCR法检测 按照Trizol试剂盒操作说明书提取血清总RNA，并通过反转录酶试剂盒Superscript Ⅲ将RNA反转录合成cDNA。采用Real Master Mix试剂盒并利用SYBR Green Ⅰ染料进行实时荧光定量PCR检测血清miR-34a表达水平，程序设定为95 ℃ 预热30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40个循环。以U6为内参基因，引物序列见表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，反应结束后收集数据，并对所得数据Ct值进行分析，采用2-ΔΔCt算法计算miR-34a相对表达量。

1.2.3酶联免疫吸附免疫试验(ELISA)检测 采用ELISA检测血清HIF-1α水平，试剂盒为人HIF-1α酶免检测试剂盒(江莱生物技术有限公司)，严格按照产品操作说明书进行。

表1 qRT-PCR引物序列设计

表2 3组一般资料比较

2 结 果

2.1一般资料比较 3组研究对象性别、年龄、BMI、胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、有无吸烟史、饮酒史等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.23组血清miR-34a和HIF-1α水平比较 3组血清miR-34a、HIF-1α水平比较差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组相比，侧支未形成组血清miR-34a水平无明显变化(P>0.05)、血清HIF-1α水平明显升高(P<0.05)；侧支形成组血清miR-34a水平明显降低(P<0.05)，血清HIF-1α水平明显升高(P<0.05)。与侧支未形成组相比，侧支形成组血清miR-34a水平明显降低(P<0.05)，血清HIF-1α水平明显升高(P<0.05)，见表3。

2.3血清miR-34a、HIF-1α水平对冠状动脉侧支形成的诊断价值 ROC曲线显示，血清miR-34a水平预测冠心病患者发生冠状动脉侧支循环形成曲线下面积为0.895，截断值为0.56，敏感度为90.4%，特异度为84.8%。血清HIF-1α水平预测冠心病患者发生冠状动脉侧支循环形成的曲线下面积为0.909，截断值为21.38 ng/mL，敏感度为91.3%，特异度为90.4%，见图1。

2.4冠心病患者侧支循环形成的影响因素分析 以是否发生侧支循环形成为因变量，以年龄、BMI、TC、TG、miR-34a、HIF-1α为自变量并进行多因素Logistic回归分析，结果显示miR-34a、年龄是侧支循环形成的保护因素，HIF-1α、TG是侧支循环形成的危险因素，见表4。

表3 血清miR-34a和HIF-1α水平表达情况

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与侧支未形成组比较

图1 血清miR-34a(A)、HIF-1α(B)水平对冠状动脉侧支形成的诊断价值

表4 多因素Logistic回归分析

3 讨 论

冠心病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变引起的管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。侧支循环的形成有助于改善冠心病患者心肌缺血的症状。miRNA是一类由22个左右的核苷酸组成内源性非编码RNA，性质较稳定，不受性别、年龄等一般情况影响，在心血管疾病发生过程中发挥重要作用[9]。有研究表明，miR-34a参与心血管疾病的发病过程[4]。另有研究表明HIF-1α与血管生成密切相关[5]，且HIF-1α是miR-34a的靶基因[6]，因此本研究主要探讨血清miR-34a、HIF-1α水平与冠心病患者侧支循环形成的关系。

侧支循环的建立可有效缓解心肌缺血状态，对控制心绞痛发作、减少心肌梗死范围、降低室壁瘤发生风险、改善患者预后具有重要意义。研究表明，侧支循环的建立受冠状动脉狭窄程度的影响，但与病变支数无关[10]。TABUCHI等[11]研究发现，冠心病患者血内皮祖细胞中miR-34a水平明显高于非冠心病患者，miR-34a水平与内皮祖细胞数量呈负相关，而内皮祖细胞在血管修复过程中发挥重要作用[12]。据此推测，miR-34a在冠心病患者中可能发挥抑制血管新生的作用。本研究发现，冠状动脉侧支循环形成的冠心病患者血清miR-34a水平明显低于冠状动脉侧支循环未形成患者，提示miR-34a在冠状动脉侧支循环形成过程中发挥重要作用。血清miR-34a判定冠心病患者侧支循环形成的曲线下面积为0.895，敏感度、特异度均大于80%，提示血清miR-34a可作为判断侧支循环建立的指标，截断值为0.56，提示当血清miR-34a水平低于0.56时，侧支循环形成的可能性较大。Logistic回归分析也显示血清miR-34a低表达是冠状动脉侧支循环形成的保护因素。

HIF-1α在缺氧条件下表达明显增加，转至细胞核，启动多种基因表达，诱导新生血管生成。此外，白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α也可诱导HIF-1α生成[13-16]。本研究中，冠心病患者(侧支形成组、侧支未形成组)血清HIF-1α均高于健康人，提示可能是心肌缺血、缺氧、炎症共同促进HIF-1α水平升高。BULYSHEVA等[17]研究表明，HIF-1α过表达猪心肌梗死区域新生血管条数高于正常猪。本研究中，侧支循环形成患者血清HIF-1α水平明显高于侧支循环未形成患者，提示血清中高水平HIF-1α可能促进冠状动脉侧支循环形成。LIN等[18]研究表明，HIF-1α是miR-34a的靶基因，miR-34a可通过负调控HIF-1α表达，参与糖尿病相关耳蜗毛细胞凋亡，猜测在冠心病患者中，miR-34a也可能调控HIF-1α表达参与冠状动脉侧支循环形成过程，但本研究未对miR-34a、HIF-1α关系做研究，还有待进一步验证。本研究ROC曲线显示，血清HIF-1α水平预测冠心病患者侧支循环形成的曲线下面积为0.909，敏感度和特异度均高于90%，截断值为21.38 ng/mL，提示当血清HIF-1α水平高于21.38 ng/mL时，侧支循环形成的可能性较大。此外Logistic回归分析也显示血清HIF-1α低水平是冠状动脉侧支循环形成的危险因素，提示高水平HIF-1α有助于冠状动脉侧支循环形成，改善心肌缺血。

综上所述，冠心病患者侧支循环形成者血清miR-34a水平降低，血清HIF-1α水平升高，检测血清miR-34a、HIF-1α水平有助于预测冠心病患者侧支循环形成情况，从而合理用药。本研究也存在一定不足，miR-34a如何调控HIF-1α参与侧支循环的具体机制还有待进一步研究。此外，本研究样本数过少，后续需进行大样本、多中心实验进一步证实。