草苁蓉环烯醚萜苷对肝癌细胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

崔香丹， 郑 峰， 朱洁波， 全吉淑， 尹学哲*

（1.延边大学 附属医院，吉林 延吉 133000；2.延边大学 医学院，吉林 延吉 133000）

如今，原发性肝细胞癌（HCC）的新发呈迅猛的增加趋势[1]，WHO揭晓的《全球癌症报告》表明，肝癌的新发和死亡人数中国居世界第一[2]。恶性肿瘤的发生与细胞凋亡、增殖紧密相关[3]。细胞凋亡是由基因调控引起的细胞环境和死亡信号变化引起的程序性细胞死亡过程。肿瘤细胞与实体肿瘤中都存在细胞凋亡，且凋亡程度的好坏直接与肿瘤的发展程度相关。

草苁蓉为中国传统的民族药，为我国二类保护植物，是大兴安岭高山地区、长白山特有植物[4]。草苁蓉环烯醚萜苷（Iridoid glycosides from Boschniakia rossica，IGBR）是草苁蓉重要活性成分，具有抑制肿瘤、诱导凋亡、抗氧化、保肝等作用[5-6]。目前对IGBR抗癌机制方面的研究受到广泛的关注。探讨二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠肝癌中IGBR对细胞凋亡及细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的作用，进一步阐明其抗癌机制。

1 材料与方法

1.1 材料

Wistar大鼠购自延边大学实验动物中心，Bax、Bcl-2多克隆抗体、TUNEL和免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥，IGBR为延边大学基础医学院全吉淑教授惠赠。

1.2 肝癌大鼠模型的制备

Wistar雄性大鼠148只，分为对照组、模型组、5-FU组及IGBR组。对照组大鼠第1天给予腹腔注射1次0.1 mL/hg生理盐水；余3组大鼠第1天腹腔注射1次200 mg/kg DEN，然后给予饮用体积分数0.05%的DEN水溶液。5-FU组大鼠腹腔注射25 mg/kg 5-FU每周3次；IGBR组大鼠灌胃500 mg/kg IGBR每日1次。实验第12、20周末处死6只动物，第28周末处死24只动物，取心脏血，肝脏福尔马林固定。

1.3 检测方法

HE染色观测肝脏病理变化，TUNEL法检测肝细胞的凋亡，免疫组化法检测Bax和Bcl-2的表达。每张切片中阳性细胞率＜5%为阴性（-）；5%～25%为弱阳性（+）；25%～50%为中等强度阳性（++）；＞50%为强阳性（+++）。

1.4 统计学处理

利用SPSS19.0统计软件，计量资料以X±s表示，计数资料以X2检验和Spearman等级相关检验表示，P＜0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝脏组织病理学改变

2.1.1 HE染色 对照组肝小叶结构正常，肝索排列正常。模型组病理变化可分为3个阶段。1）肝炎阶段（12周）:可见炎性反应、坏死和淋巴细胞浸润、胶原沉积及凋亡小体。2）肝硬化阶段（20周）:可见结节性肝细胞再生，不同大小的肝结节，肝小叶正常结构破坏、肝索排列紊乱。3）肝癌阶段（28周）:可见肝细胞核深染，肝细胞变性、增生，部分可见癌细胞增生。5-FU组及IGBR组病理变化较模型组明显改善，但两组间无明显差异。

2.1.2 肝细胞凋亡染色 对照组大鼠肝细胞凋亡稀少，着色浅。与对照组比较，模型组细胞凋亡显著增加，胞质呈棕黄色，凋亡的肝细胞固缩、核浓缩、核仁消失，差异有统计学意义（X2=11.510，P＜0.01）。与模型组比较，5-FU组与IGBR组凋亡明显增多，差异有统计学意义 （5-FU组X2=11.147，IGBR组X2=7.813；P＜0.05），但两组间无显著差异（X2=2.424，P＞0.05），（见表 1 和图 1）。

图1 肝组织TUNEL及Bax、Bcl-2免疫组化观察结果(×100)Fig.1 Observation of TUNE and Immunohistochemical observation of Bax,Bcl-2of liver sections(×100)

表1 肝细胞凋亡检测及Bax、Bcl-2在各组大鼠肝组织中的表达情况Table 1 Apoptosis of liver cells and the expression of Bax and Bcl-2 in liver tissue of rats in each group

2.2 Bax和Bcl-2免疫组化染色结果

Bax和Bcl-2阳性细胞主要分布于不典型增生灶和癌灶中，表达于胞浆（见表1，图1）。与对照组比较，模型组Bax和Bcl-2表达明显增强（Bax X2=15.607，Bcl-2 X2=6.276；P＜0.05）；与模型组比较，5-FU组和IGBR组Bax表达明显增强，而Bcl-2表达明显减弱 （5-FU组Bax X2=9.202，IGBR组Bax X2=7.895；5-FU 组 Bcl-2 X2=7.719，IGBR 组 Bcl-2 X2=6.907；P＜0.05），两组间无显著差异（Bax X2=0.956，Bcl-2 X2=2.827；P＞0.05）。

2.3 各组大鼠肝组织Bax与Bcl-2之间的相关性

Bax表达与Bcl-2表达，对照组无相关性（r=-0.090，P＞0.05），模型组呈负相关 （r=-0.302，P＜0.05），5-FU 组呈负相关 （r=-0.844，P＜0.05），IGBR组呈负相关（r=-0.766，P＜0.05）。

3 讨 论

DEN诱发的大鼠肝癌多为肝细胞肝癌，造模简单易成功。研究表明，DEN诱癌整个过程与人类肝细胞癌进程相似[6]。DEN在致癌过程中损伤肝细胞正常结构，使肝细胞代偿性增生。随着给药时间的延长，DEN在体内的毒性堆积，可启动癌变机制，肝组织病变程度也逐渐加重，引起大鼠的中毒反应，并导致肝癌的形成。本实验用DEN诱发大鼠肝癌过程中发现，造模第28周时HE染色结果显示肝细胞核大、深染、变性、异型增生，可见癌变细胞，成功地诱发了肝癌模型。与模型组相比，IGBR组和5-FU组病理变化均减轻，表明IGBR阻止了DEN的致癌进程，保护了肝组织。

肝癌的发生机制非常复杂，与细胞的增殖和凋亡发生异常相关。细胞凋亡是细胞的程序性死亡，能调控机体发育和内环境稳定[6-7]。研发及评估抗肿瘤药物的重要指标与肿瘤细胞的增殖、凋亡密切相关[8-9]。有大量的研究表明，抗凋亡因子在肿瘤细胞株和实体肿瘤中表达增加，使正常的凋亡程序受到抑制，而增殖能力不断增强[10]。

细胞凋亡的发生受多种基因的调控，其中Bax和Bcl-2备受关注，且其比值决定细胞接受凋亡信号后存活与否，在调控凋亡中起关键作用[11-13]。正常情况下，Bax和Bcl-2的相互调节处于相对稳定的状态。当诱发癌变时，Bax/Bcl-2表达失衡可加重癌变的进展。大量研究表明，中草药对细胞的凋亡有不同程度的诱导效果，辅助或协同细胞毒药物对癌细胞起杀伤作用，其作用机制与凋亡相关蛋白的表达失衡相关[14]。

Bax为凋亡促进蛋白，Bcl-2为凋亡抑制蛋白，细胞中Bax升高则形成Bax同源二聚体，加速凋亡；反之形成Bax/Bcl-2异源二聚体，而抑制凋亡[15-16]。研究报道，肝癌和许多肿瘤细胞凋亡的增加，与Bax/Bcl-2表达失衡有关[17-20]。抑制凋亡蛋白与促凋亡蛋白的比例高低，反映出细胞凋亡的能力大小[21]。

4 结语

本实验中除对照组，细胞凋亡均明显增多。5-FU与IGBR干预后，上调肝癌组织中Bax基因表达，而下调Bcl-2基因表达，并且Bax/Bcl-2比例也随之升高，表明IGBR可使癌变的细胞发生凋亡，进而抑制肝癌的进展。IGBR可诱发细胞凋亡，抑制肝癌细胞增值，其机制可能与Bax蛋白增多和Bcl-2蛋白减少有关。