蝙蝠蛾拟青霉治疗1型糖尿病活性研究

2019-04-24胡馨予郑德庆

食品与生物技术学报 2019年12期

高寒，赵毅，胡馨予，郑德庆

（1.长春医学高等专科学校，吉林长春 130031；2.吉林大学第一医院创伤骨科，吉林长春 130061；3.沐石河镇中心校，吉林长春 130508））

糖尿病是威胁人类健康的重大代谢类疾病之一，是一类由胰岛素分泌不足或作用障碍导致的慢性代谢疾病，持续的高血糖导致周围组织对胰岛素的耐受性增高，胰腺组织损伤，进而引起机体脂质、蛋白质代谢紊乱，导致糖尿病并发症的发生[1]。随着人们生活水平的提高，人口老龄化及肥胖发病率的增加，糖尿病发病趋势呈逐年上升的趋势[2]。据统计，2013年，全球糖尿病患者人数为3 800万，到2035年，将会有5 900万人罹患糖尿病[3]。目前对糖尿病的治疗多停留在对血糖的控制方面，通过长期服用药物保持血糖的稳定，例如注射胰岛素、口服降血糖药物等，但长期的药物治疗不仅给机体带来副作用，更增加患者的经济和心里压力，给患者及家庭带来巨大的痛苦。因此开发新型治疗糖尿病的中药制剂或探究新的药用真菌显得额外重要，应用前景巨大。

冬虫夏草是我国珍贵野生药用资源，具有显著的抗氧化、抗肿瘤、免疫增强等活性[4]。蝙蝠蛾拟青霉为野生冬虫夏草中分离得到的内寄生菌，具有显著的抗肿瘤及肾炎保护活性[5-6]。本研究将采用腹腔注射链佐脲菌素方法建立1型糖尿病大鼠模型，考察蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体（PH）对糖尿病模型大鼠血糖水平的调节作用，并初步阐明其对降血糖活性作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性 Sprague Dawley 大鼠，180~220 g，6~8 周龄，SPF级，购买自辽宁长生生物技术有限公司。动物许可证号:SCXK（辽）-2015-0001。

1.2 实验仪器

pHs-2c精密酸度计，上海第三仪器分析厂制造；GSY-II恒温水浴锅，北京市医疗设备厂制造；752紫外可见分光光度计，上海分析仪器厂制造；CentrifuGe 5810R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司产品；ELX800酶标仪，BIOTEK产品；轮转切片机，浙江金华益迪医疗设备厂制造；TE2000倒置式生物显微镜，日本尼康产品。

1.3 实验试剂及配制

蝙蝠蛾拟青霉经蝙蝠蛾拟青霉RCEF1429（购买于安徽农业大学菌株保藏中心），诱变得到，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体由本实验室液体发酵获得，经过真空冷冻干燥，制成蝙蝠蛾拟青霉菌粉待用，经检测其中多糖质量分数4.38%，蛋白质质量分数10.52%，腺苷质量分数0.24%，氨基酸质量分数15.26%，虫草素质量分数6.32%。

STZ（Streptozotocin），购于上海源叶生物试剂有限公司；盐酸二甲双胍片，购买自北京京丰制药有限公司；二甲苯、无水乙醇、石蜡、液体石蜡等，购买自国药集团。

实验检测试剂盒:RAT INS ELISA KIT，购买自上海源叶生物试剂有限公司。

糖原检测试剂盒（肝糖原/肌糖原）、SOD测定试剂盒、GSH-Px测定试剂盒、糖化血红蛋白检测试剂盒、HE染色试剂盒，均购买自南京建成生物公司。

0.1 mol/L，pH 4.5的柠檬酸缓冲液的配制:（A）准确称量21.01 g柠檬酸，溶于1 L蒸馏水；（B）准确称取29.41 g柠檬酸三钠，溶于1 L蒸馏水；取A液280 mL与220 mL B液混合，蒸馏水定溶至1 L，备用。

STZ溶液的配制:准确称取STZ粉末，避光状态下溶解于上述配制好的柠檬酸缓冲液中，置于冰浴中，配制完毕后需在30 min内注射完毕。

1.4 实验方法

1.4.1 1型糖尿病大鼠模型的建立[7]大鼠适用性喂养1周后，禁食不禁水16 h，采用腹腔注射预冷的STZ溶液，注射剂量为65 mg/kg。注射后4 h，大鼠灌胃给予2.5 g/kg葡萄糖溶液，72 h后，大鼠尾静脉取血，测定大鼠空腹血糖值，血糖高于13.8 mmol/L为造模成功。空白对照组大鼠腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液（pH 4.3）。大鼠灌胃给药期间，每天更换新鲜用水，保证供水新鲜；每天更换垫料，保证生活环境的清洁；饲养室温度保持为（22±1）℃；湿度为50%～65%，昼夜时间为12 h/12 h（日照时间为7:00～19:00）。

1.4.2 大鼠分组及给药将建模成功大鼠随机分为模型组（Model，灌胃5 mL/kg 0.5 g/mL羧甲基纤维素钠溶液）、阳性对照组（Met，灌胃0.12 g/kg盐酸二甲双胍）、低剂量组（PH（L），灌胃 1.0 g/kg 蝙蝠蛾拟青霉菌粉溶液）、高剂量组（PH（H），灌胃2.0 g/kg蝙蝠蛾拟青霉菌粉溶液）、空白对照组给予等量生理盐水。每组10只，保证大鼠每天灌胃时间基本相同，灌胃期间，大鼠每周称重，测定空腹血糖值。

1.4.3 样品收集大鼠给药4周后，禁食不禁水12h，大鼠心脏取血，收集血浆及红细胞，按照相应试剂盒说明书检测大鼠胰岛素、糖化血红蛋白、SOD、GSH-Px水平。

大鼠脱颈处死，快速收集大鼠肝脏及肌肉组织，检测大鼠肝糖原、肌糖原水平。

1.4.4 病理形态学观察收集大鼠肾脏及胰岛组织，采用4 g/mL多聚甲醛固定，4℃保存。常规石蜡包埋、切片。采用HE染色，光镜观察进行病理分析。1.4.5 统计学处理实验结果采用均值±SD（）方法表示，采用SPSS16.0软件进行检测，以P＜0.05作为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 PH对糖尿病大鼠血糖及体质量的影响

实验过程中，大鼠体质量变化如表1所示，大鼠建模一周后，与CTRL相比，Model组大鼠体质量显著降低（（228.1±17.2） g vs （268.8±7.3） g，P＜0.01）。大鼠给药4周后，与Model组相比，各治疗组大鼠体质量均显著增加（P＜0.01）。表明PH对糖尿病大鼠体质量具有很好的恢复作用，且其恢复程度与盐酸二甲双胍相近。

表1 蝙蝠蛾拟青霉对糖尿病大鼠体质量的影响（，n=10）Table 1 Effects of Paecilomyces hepiali on body weight of diabetic rats（，n=10） g

注:与空白组相比，##P＜0.01，###P＜0.001；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

时间第0周第1周第2周第3周第4周CTRL 247.6±7.8 268.8±7.3 290.8±11.8 309.7±17.3 351.4±20.3 Model 239.6±7.5 228.1±17.2##213.5±20.4###219.7±20.1###221.7±20.1###Met 254.8±10.3 232.1±12.2 229.7±14.5 250.4±19.4**273.3±17.3**PH(L)246.4±5.8 219.2±15.8 215.7±13.0 239.6±17.4*258.4±19.4**PH(H)245.4±8.8 222.6±11.8 232.4±16.7 253.3±17.3**289.4±14.8**

大鼠血糖变化如表2所示。血糖是细胞组织能量供应的主要物质，长期的高血糖是诊断糖尿病的最直观指标。在本实验中，STZ注射一周后，大鼠血糖值显著增加（（17.3±1.9） vs （4.5±0.9），P＜0.01），在大鼠给药期间，Model组大鼠血糖值稳定，均显著高于13.8 mmol/L，证明实验模型具有很好的稳定性，数据可靠。大鼠给药4周后，与Model组相比，各给药组大鼠空腹血糖均有降低（P＜0.05），其中Met治疗组、PH （H）治疗组大鼠血糖水平显著下降（P＜0.01），提示蝙蝠蛾拟青霉菌丝体具有显著的降血糖活性。

表2 蝙蝠蛾拟青霉对糖尿病大鼠血糖的影响n=10）Table 2 Effect of Paecilomyces hepiali on blood glucose of diabetic ratsn=10）

注:与空白组相比，###P＜0.001；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

时间第0周第1周第2周第3周第4周CTRL 4.6±0.8 4.5±0.9 4.9±0.9 4.7±0.7 4.4±1.1 Model 4.5±0.6 17.3±1.9###20.6±7.0###19.5±6.5###18.8±4.6###Met 4.5±0.8 17.4±3.5 17.5±2.4 15.3±2.2*12.4±2.1**PH(L)5.2±1.1 17.0±5.1 18.5±3.9 16.8±1.7 13.6±5.1*PH(H)4.6±0.7 16.8±4.8 17.9±1.2 13.9±2.8**10.6±6.9**

2.2 PH对糖尿病大鼠血清胰岛素水平的影响

实验动物的血清胰岛素水平见图1，STZ能破坏胰岛β细胞，降低大鼠的血清胰岛素含量。结果显示，Model组大鼠的胰岛素水平显著低于CTRL组大鼠（P＜0.01），同样证明了STZ对大鼠胰岛细胞的破坏作用。与Model组大鼠相比，给药组大鼠血清胰岛素水平均有不同程度的提升（P＜0.05），其中PH（H）治疗组大鼠血清胰岛素水平显著增加（P＜0.01）。以上的实验结果提示PH的降血糖活性的机制可能是促进糖尿病大鼠胰岛β细胞分泌胰岛素，亦或是促进胰岛β细胞的再生或修复。

图1 蝙蝠蛾拟青霉对大鼠胰岛素水平的影响（，n=10）Fig.1 Effects of Paecilomyces hepiali on insulin of diabetic rats（，n=10）

2.3 PH对糖尿病大鼠糖化血红蛋白水平的影响

糖化血红蛋白（HbA1c）是临床上常用的反映血糖控制水平的一个重要指标，结果如图2所示。由结果可以看出，与空白大鼠相比，Model组大鼠糖化血红蛋白水平显著升高（P＜0.01）。与模型组大鼠相比，Met和PH（H）均能显著降低糖尿病大鼠糖化血红蛋白含量（P＜0.05），说明PH的降糖活性与其促进糖原合成或抑制糖原分解有关，增加糖尿病大鼠糖的储存能力，对糖尿病大鼠糖代谢具有一定的调节能力。

图2 蝙蝠蛾拟青霉对大鼠糖化血红蛋白水平的影响（n=10）Fig.2 Effects of Paecilomyces hepiali on the level of Glycated hemoglobin in diabetic rats（，n=10）

2.4 PH对糖尿病大鼠糖原水平的影响

图3 蝙蝠蛾拟青霉对大鼠肝糖原、肌糖原水平的影响n=10）Fig.3 Effects of Paecilomyces hepiali on liver glycogen，muscle glycogen of diabetic rats，n=10）

研究考察了PH对糖尿病大鼠糖原质量分数的影响，结果如图3所示。由结果可以看出，与空白大鼠相比，Model组大鼠肝糖原、肌糖原水平均明显降低（P＜0.01）。Met和PH均能显著提高糖尿病大鼠糖原水平（P＜0.05），说明PH的降糖活性与其促进糖原合成或抑制糖原分解有关，增加糖尿病大鼠糖的储存能力，对糖尿病大鼠糖代谢具有一定的调节能力。

2.5 PH对糖尿病大鼠氧化应激水平的影响

氧化应激被认为是与糖尿病有关并发症的主要发病机理。在本研究中，检测给药4周后大鼠血清中SOD、GSH-Px的含量，结果如图4所示。结果显示，与CTRL组大鼠相比，Model组大鼠血清SOD、GSH-Px 均显著下降（P＜0.01，图 4），说明 STZ导致糖尿病大鼠发生过氧化反应，自身清除自由基能力下降，氧化应激水平升高，而各给药组大鼠SOD、 GSH-Px水平具有不同的提高（P＜0.05），推测药物可能通过增加机体的抗氧化活性，减小机体氧化应激，降低血糖。

图4 蝙蝠蛾拟青霉对大鼠SOD、GSH-Px水平的影响 s，n=10）Fig.4 Effects of Paecilomyces hepiali on SOD，GSH-Px of diabetic rats，n=10）

2.6 PH对糖尿病大鼠肾脏结构的影响

采用HE染色实验考察PH对大鼠肾脏结构的影响，结果见图5，可以看出，糖尿病大鼠肾脏组织发生明显的病理学改变，肾小球肥大，基质膜增厚，大量炎性细胞浸润，肾小球细胞萎缩。与模型组相比，各给药组大鼠肾脏病变均有明显改善，肾小球结构完整，无明显炎性细胞浸润，证明蝙蝠蛾拟青霉菌丝体对糖尿病肾病具有很好的预防和治疗作用。

图5 蝙蝠蛾拟青霉对大鼠肾脏结构的影响（x±s，n=10）Fig.5 Effects of Paecilomyces hepialid on structures of kidney in diabetic rats（x±s，n=10）

2.7 PH对糖尿病大鼠胰岛结构的影响

采用HE染色实验考察PH对大鼠胰岛结构的影响，结果如图6所示，可以看出，正常小鼠胰腺组织腺泡细胞包膜完整，胰岛为圆形或卵圆形结构，边界清晰，且胰岛团内细胞较多，细胞质丰富。与正常小鼠相比，糖尿病模型组小鼠胰岛团内细胞坏死明显，数量减少，胰岛结构杂乱，小鼠给药PH 4周后，胰岛细胞出现再生现象，细胞排列整齐，胞质丰富，PH（H）给药组小鼠胰岛组织恢复至正常水平。

2.8 讨论

本章采用化学药物STZ诱导建立1型糖尿病大鼠模型，考察蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体的调节血糖作用，并对其初步降血糖机制进行分析。实验结果证明，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体具有显著的降血糖活性，其活性可能是通过促进机体葡萄糖代谢，增加血糖合成及机体的抗氧化能力实现的。

胰岛素是胰腺分泌的多肽类激素，是机体唯一负向调节血糖的激素，胰岛素可刺激肝脏、肌肉、脂肪组织摄取和利用葡萄糖，抑制糖原的分解并阻止肝脏中糖异生和脂解作用。在本研究中，通过实验结果推测，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体通过刺激胰岛β细胞或调解机体内外环境的平衡，保护、修复和改善胰岛β细胞功能，促进胰岛素分泌，增加血清胰岛素含量而达到降血糖目的[8-10]。糖化血红蛋白（HbA1）是一项非常重要的检测指标，HbA1主要包括 HbA1a、b、c，其中 HbA1c 是主要组成成分，最能确切反映血中葡萄糖特别是真糖水平的真实情况[11]，本研究发现，PH能够显著降低糖化血糖蛋白水平，可以预防油糖化血红蛋白含量升高引起的糖尿病并发症的发生，对糖尿病患者有重要意义。

图6 蝙蝠蛾拟青霉对大鼠胰岛结构的影响n=10）Fig.6 Effects of Paecilomyces hepialid on structures of pancreas in diabetic ratsn=10）

氧化应激被定义为机体自由基或者活性氧的产生与抗氧化系统的失衡。越来越多的实验和临床研究表明氧化应激在糖尿病及并发症的发病过程中扮演重要角色[12]。糖尿病也通常与自由基或者受损的抗氧化系统的增加伴随发生，二者相互影响。氧化应激可损伤胰岛β细胞、降低外周组织对胰岛素的敏感性、抑制胰岛素表达、合成与释放等，是糖尿病发病机制中的一个重要原因。在糖尿病的发病过程中，长时间地高血糖水平也可以加重氧化应激状况，进而加重氧化应激程度，更会恶化糖尿病的病情，导致多种并发症的出现。因而，缓解氧化应激状态有望成为治疗糖尿病的另一重要思路[13-14]。GSH-Px和SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，有效清除脂质过氧化物、超氧自由基，保护细胞膜结构和功能的完整性。蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体显著增加糖尿病大鼠血清GSH-Px、SOD含量，增加机体抗氧化活性，保护机体组织免受氧化应激损伤，进而降低机体血糖。大鼠肾脏及胰岛组织病理学切片实验结果显示，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体对大鼠糖尿病肾病具有很好的预防和治疗作用，同时能够明显减轻氧化应激对糖尿病大鼠胰岛形态结构的损伤。