特发性膜性肾病患者血清CTLA-4水平 及其临床意义

方华伟，郑晓荣

（嘉兴市第二医院 肾内科，浙江 嘉兴 314000）

特发性膜性肾病是膜性肾病的主要类型，也是成人肾病综合征最常见的原因[1-2]。肾小球上皮侧抗体介导免疫复合物形成，其是特发性膜性肾病肾组织损伤的主要机制[3]。细胞毒性T淋巴细胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4,CTLA-4）具有多种免疫学效应，具有下调免疫应答作用，与多种免疫性疾病关系密切[4-5]。本文对特发性膜性肾病患者血清可溶性细胞毒性T细胞相关抗原4（soluble cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,sCTLA-4）水平及其临床意义进行研究，为临床治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月—2017年6月嘉兴市第二医院肾内科特发性膜性肾病患者80例作为膜性肾病组，同期80例健康体检者作为对照组。膜性肾病组：男性54例，女性26例；年龄（48.57±13.24）岁。对照组：男性51例，女性29例；年龄（47.59±14.12）岁。纳入标准：特发性膜性肾病患者均经活检确诊为特发性膜性肾病，对照组患者经体检身体健康。排除标准：特发性膜性肾病患者近3个月内使用过环磷酰胺、甲基泼尼松龙、他克莫司、环孢素A及霉酚酸酯等免疫抑制剂；系统性红斑狼疮、乙肝病毒相关性肾炎、过敏性紫癜及肿瘤等继发性膜性肾病；病史中有其他自身免疫性疾病；对照组患内外科等基础疾病，肝肾功能等体检检查结果异常。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 特发性膜性肾病治疗方法所有患者入院后再降压、利尿、抗凝及调脂等常规治疗的基础上给予泼尼松龙联合环磷酰胺治疗。泼尼松龙的起始剂量为0.8～1.0 mg/（kg·d），维持2个月后每2个星期减原始剂量的10%至停用；环磷酰胺的初始剂量为1～2 g/d，3个月后开始减量，6个月时维持0.75～1.50 g/d，12个月时维持0.5～1.0 g/d，直至停药。

1.2.2 临床资料收集收集患者性别、年龄及治疗情况，治疗前和治疗后（治疗12个月时）实验室检查指标[血清白蛋白、24 h尿蛋白量及血肌酐（serum creatiroine,Scr）]等资料。

1.2.3 疗效评价治疗12个月时判断疗效，完全缓解：患者治疗后尿蛋白＜0.3 g/d，肾功能和血清白蛋白恢复正常；部分缓解：治疗后患者血清白蛋白＞ 30 g/l，尿蛋白减少≥50%；无效：治疗后未达到上述标准者。

1.2.4 调节性T细胞测定对照组患者抽取体检当天清晨外周静脉血、膜性肾病组患者抽取治疗前和治疗后（治疗12个月）外周静脉血，取100μl乙二胺四乙酸抗凝全血，加入流式专用管中，加入CD25-PE和CD4-FITC混匀，孵育30 min标记CD4+、CD25+T细胞，经过穿膜、封闭后，加入APC-抗人Foxp3单抗孵育30 min，用FACS Aria型流式细胞仪（美国BD公司）检测调节T细胞（CD4+、CD25+及Foxp3+T细胞）在外周淋巴细胞中的数量（实验所用所有抗体购自美国Beckman Coulter公司）。

1.2.5 血清sCTLA-4水平测定对照组患者抽取体检当天清晨外周静脉血、膜性肾病组患者抽取治疗前和治疗后（治疗12个月）外周静脉血，采用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法测定血清sCTLA-4水平（ELISA试剂盒购自奥地利Bender Medsystems公司）。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19．0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；相关性分析用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者各临床指标比较

两组血清白蛋白、Scr、24 h尿蛋白量、调节性细胞计数及sCTLA-4水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；膜性肾病组患者血清白蛋白、调节性细胞计数及sCTLA-4水平低于对照组，而Scr和24 h尿蛋白量高于对照组。见表1。

2.2 膜性肾病不同危险程度患者各临床指标比较

膜性肾病中高危组和低危组血清白蛋白、Scr、24 h尿蛋白量、调节性细胞计数及sCTLA-4水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；膜性肾病中高危组患者血清白蛋白、调节性细胞计数及sCTLA-4水平均低于低危组，而Scr和24 h尿蛋白量高于低危组。见表2。

2.3 膜性肾病患者治疗前后各临床指标比较

膜性肾病患者治疗前后血清白蛋白、Scr、24 h尿蛋白量、调节性细胞计数及sCTLA-4水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05）；膜性肾病患者治疗后血清白蛋白、调节性细胞计数及sCTLA-4水平均高于治疗前，而Scr和24 h尿蛋白量低于治疗前。见表3。

2.4 膜性肾病不同疗效组各临床指标比较

不同疗效组血清白蛋白、Scr、24 h尿蛋白量、调节性细胞计数及sCTLA-4水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。部分缓解和完全缓解患者血清白蛋白、调节性细胞计数及sCTLA-4水平均高于无效患者，而Scr和24 h尿蛋白量低于无效患者；完全缓解患者血清白蛋白、调节性细胞计数及sCTLA-4水平均高于部分缓解患者，而Scr和24 h尿蛋白量均低于部分缓解患者。见表4。

2.5 治疗前sCTLA-4水平与各临床指标的相关性分析

膜性肾病患者治疗前sCTLA-4水平与血清白蛋白、调节性细胞计数呈正相关（r=0584和6.421，均P=0.000），与Scr、24 h尿蛋白量呈负相关（r=-0547和-0.628，均P=0.000）。

表1 两组患者各临床指标比较（n=80，±s）

表1 两组患者各临床指标比较（n=80，±s）

组别 血清白蛋白/（g/L） Scr/（μmol/L） 24 h尿蛋白量/g 调节性细胞计数/（个/μl） sCTLA-4/（ng/ml）膜性肾病组 25.46±5.42 86.47±15.32 5.13±1.42 21.73±4.65 0.53±0.18对照组 44.15±6.23 58.35±13.24 0.04±0.01 32.84±5.18 0.98±0.21 t值 20.244 12.421 32.060 14.275 14.552 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 膜性肾病不同危险程度患者各临床指标比较（±s）

表2 膜性肾病不同危险程度患者各临床指标比较（±s）

组别 n 血清白蛋白/（g/L） Scr/（μmol/L） 24 h尿蛋白量/g 调节性细胞计数/（个/μl） sCTLA-4/（ng/ml）中高危组 63 23.71±5.08 92.16±13.03 5.74±1.06 18.35±4.82 0.49±0.16低危组 17 31.64±5.23 77.25±12.19 2.68±0.77 24.67±4.73 0.64±0.17 t值 5.677 4.241 11.115 4.816 3.386 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 膜性肾病患者治疗前后各临床指标比较（n=80，±s）

表3 膜性肾病患者治疗前后各临床指标比较（n=80，±s）

组别 血清白蛋白/（g/L） Scr/（μmol/L） 24 h尿蛋白量/g 调节性细胞计数/（个/μl） sCTLA-4/（ng/ml）治疗前 25.46±5.42 86.47±15.32 5.13±1.42 21.73±4.65 0.53±0.18治疗后 38.47±5.83 66.45±14.86 1.21±0.32 27.68±4.82 0.82±0.20差值 -13.01±1.73 20.02±3.26 3.92±0.84 -5.95±0.93 -0.29±0.06 t值 67.263 54.928 41.740 57.224 43.231 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 不同疗效组血清白蛋白、Scr、24 h尿蛋白量、调节性细胞和sCTLA-4水平比较（±s）

表4 不同疗效组血清白蛋白、Scr、24 h尿蛋白量、调节性细胞和sCTLA-4水平比较（±s）

注：1）与无效比较，P＜0.05，2）与部分缓解比较，P＜0.05

组别 n 血清白蛋白/（g/L） Scr/（μmol/L） 24 h尿蛋白量/g 调节性细胞计数/（个/μl） sCTLA-4/（ng/ml）无效 21 24.42±5.38 83.24±14.53 4.97±1.23 23.42±4.16 0.56±0.15部分缓解 16 36.47±5.971） 68.69±14.731） 1.53±0.381） 26.75±4.721） 0.77±0.171）完全缓解 43 41.32±6.061）2） 62.14±14.651）2） 0.21±0.071）2） 30.79±4.631）2） 0.93±0.141）2）F值 58.506 14.669 378.08 19.487 44.003 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

膜性肾病主要的治疗为免疫抑制药物治疗，部分患者经免疫抑制药物治疗后完全康复；部分患者经免疫抑制药物治疗后尿蛋白转阴；也有部分患者治疗无效，可能发展为肾脏病末期，需要透析维持治疗[6-8]。特发性膜性肾病在特定条件下抗原暴露，被树突细胞识别并递呈给CD4+T细胞，CD4+T细胞在白细胞介素4的作用下被激活，并分为呈Th2细胞。Th2细胞分泌细胞因子促进Th2分化[9-10]，Th2分泌的细胞因子激活B淋巴细胞，促进特异性抗体IgG4释放，形成原位免疫复合物，激活补体系统，促进基底膜增厚，从而引起足细胞损伤，发生蛋白尿[11-12]。

CTLA-4是CD28同源分子，CTLA-4可和CD28竞争性结合B7-1分子和B7-2分子，干扰Th1/2的转录活性，影响Th细胞亚群发育，引起T细胞功能下 降[13]，其主要生物学活性为下调T细胞反应，抑制免疫应答反应[14]。sCTLA-4是膜结合CTLA-4蛋白的可变剪接物，sCTLA-4序列缺失膜结合区氨基酸片段，其表达量随着T细胞的活化而减少，而膜结合CTLA-4的表达量则随着T细胞的活化而增加[15-16]。本研究发现，特发性膜性肾病患者血清sCTLA-4水平下降，血清sCTLA-4水平可为特发性膜性肾病的诊断提供依据，其水平下降程度在疾病严重程度、疗效判断及预后评估中具有重要意义。分析特发性膜性肾病时血清sCTLA-4水平下降，从而对Th1/2的转录活性的抑制作用降低，上调T细胞反应，引起免疫应答反应，促进肾小球上皮细胞或基底膜免疫复合物的沉积；促进基底膜增厚，引起足细胞损伤，发生蛋白尿。sCTLA-4水平越低，对Th1/2的转录活性抑制作用越低，引起足细胞损伤越严重，尿蛋白水平越高。治疗后，随着sCTLA-4水平升高，对Th1/2的转录活性抑制作用增强，对足细胞损伤减轻，蛋白尿减少。

调节性T细胞（CD4+、CD25+Treg）可 抑 制CD4+T淋巴细胞增殖，抑制自身反应性CD8+细胞和白细胞介素2等细胞因子分泌[17-18]。调节性T细胞还可抑制抗原递呈细胞活化Th细胞、Th细胞活化B细胞及B细胞产生抗体，从而减弱免疫复合物对组织的损伤[19]。研究发现，在膜性肾病患者外周血中调节性T细胞数量也减少，调节性T细胞数量异常和膜性肾病的发生关系密切[20]。调节性T细胞可表达CTLA-4，降低CTLA-4水平可抑制调节性T细胞活性，减弱其对免疫反应的抑制作用，从而引起自身免疫性疾病的发生[21-22]。本研究发现，膜性肾病患者外周血调节性T细胞数量减少，血清sCTLA-4水平和外周血调节性T细胞数量呈正相关。表明血清sCTLA-4水平在某种程度上可反应机体的免疫状态。

综上所述，特发性膜性肾病患者血清sCTLA-4水平下降，抑制其对调节性T细胞的活化，降低调节性T细胞对免疫的抑制作用，从而增强免疫复合物对肾组织的损伤。