探究TRPV1激活对离体壁细胞胃酸分泌的影响

刘宇涵

摘 要 目的：探究TRPV1激活及激活程度對离体胃壁细胞胃酸分泌的影响。方法：取大鼠离体胃壁细胞，借助辣椒素（capsaicin，CAP）及钌红作用于TRPV1，测量H+-K+-ATP酶活性判断胃酸分泌情况。结果：不同浓度CAP对胃酸分泌作用不定，钌红同理。结论：对于离体壁细胞，TRPV1激活对于其胃酸分泌作用不固定。

关键词 大鼠 TRPV1 离体胃壁细胞 胃酸分泌 CAP 钌红 H+-K+-ATP酶

中图分类号：R57 文献标识码：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2019.02.027

Investigate the Effect of TRPV1 Activation on Gastric

Acid Secretion in Isolated Parietal Cells

LIU Yuhan

（Zhejiang University， Hangzhou， Zhejiang 310029）

Abstract Objective： To investigate the effects of TRPV1 activation and activation on gastric acid secretion of gastric parietal cells in vitro. Methods： Rat gastric parietal cells were isolated and treated with capsaicin （CAP） and ruthenium red on TRPV1. The activity of H +-K +-ATP enzyme was measured to determine gastric acid secretion. Results： The effects of different concentrations of CAP on gastric acid secretion were uncertain， and ruthenium red was the same. Conclusion： For isolated parietal cells， the effect of TRPV1 activation on gastric acid secretion is not fixed.

Keywords rat； TRPV1； isolated gastric parietal cells； gastric acid secretion； CAP； ruthenium red； H +-K +-ATP enzyme

TRPV1是瞬态电压感受器阳离子通道，可被CAP所激发。钌红作为电压敏感的钙离子通道抑制剂，可拮抗CAP的激动作用。TRPV1广泛分布于神经纤维支配的系统和组织，在壁细胞中也有分布，可调节胃酸分泌。为排除神经系统干扰，本实验对象为离体胃壁细胞。根据测得的吸光度值计算H+-K+-ATP酶活性，从而判断胃酸分泌功能。

1 实验对象

雄性健康SD大鼠13只，6周龄左右，体重180？0g。

2 实验方法

2.1 分离培养、鉴定并保存壁细胞

（1）配置壁细胞分离及培养所需液体 消化液用Mdeium A配制，链霉蛋白酶浓度为1 g/L。基础培养液：Ham S F-12/DMEM （ 1=1 Gibco） ，按要求加入Na2CO3 ，调pH在7.1～7.3，过滤除菌，分装备用。

（2）大鼠胃粘膜壁细胞的分离及原代培养 取非禁食SD大鼠，处死取胃，放入冰冷Hanks液中，在胃底作小切口，将胃翻转，用Hanks液洗去食物残渣和血迹，结扎。之后用注射器将消化酶注入胃袋，注满为止。将翻转后的胃囊先后放入Medium A、B中消化并收集细胞。

2.2 原代培养的大鼠胃壁细胞的鉴定

将细胞制成悬液，加入终浓度100 mol/L的吖啶橙孵育5 min，置荧光显微镜下观察，细胞核发黄绿色荧光，胞质发红色荧光，即可确定为壁细胞。

2.3 预实验：确定激活TRPV1受体的CAP浓度

在培养有胃壁细胞的培养皿中，将CAP终浓度分别调整为：0、1 mol/L、10、0.1、1、10mmol/L。测定H+-K+-ATP酶活性。

2.4 测定壁细胞H+-K+-ATP酶活性

将所得壁细胞等量随机分为四组A、B、C、D（依次对应激动剂+拮抗剂组、激动剂组、拮抗剂组、空白对照组），分别加入试剂。分光光度计660 nm处检测各样本对照管、测定管及标准管OD值。

2.5 统计分析

将分别重复了5次的4组实验数值用方差分析处理。

3 实验结果

3.1 CAP组与CAP加钌红组的壁细胞酶活性随CAP浓度变化

其中空白处为去除负值（去除理由见实验讨论）、其余数据经Q检验无离群值均保留（表1）。

3.2 上述结果总结

在编号1、4、5中：两组酶活力无显著性差异，表明钌红对CAP无显著影响。在6实验中：阻断组酶活力显著大于非阻断组，表明钌红对CAP的激活呈增益作用。在2、3实验中：非阻断组酶活力远大于阻断组，表明钌红对CAP的激活呈抑制作用。CAP浓度为100umol/L时，六次实验的CAP组中有三次酶活力高于15，故CAP最适浓度应位于100umol/L左右。在一定范围内，CAP浓度增加，酶活性升高，增加到一定程度呈下降趋势，当CAP浓度非常高时，酶活性又显著升高。

4 实验讨论

（1）TRPV1的特点与功能：TRPV1是一类具有 6个跨膜区的膜蛋白，广泛分布于哺乳动物的感觉神经纤维。[1]研究发现TRPV1具有以下生物学特性：a.TRPV1被激活时，能引起Ca2+、Mg2 +等阳离子内流；b.可以被多种理化因素激活；c.可以被多种炎症介质激活；d.参与体内多种生理和病理过程。[2]其中，TRPV1 在支配胃肠道的感觉神经元及纤维内广泛表达，可参与黏膜保护、胃肠道运动等。

（2）钌红对于CAP的作用不定：钌红是一种阳离子染料，为TRPV1受体的竞争拮抗剂。推测其有两个与钌红结合的位点，一个为可逆性位点，可逆地阻断CAP诱发的反应。另一个为不可逆性结合位点，它参与TRPV1的脱敏作用。[3]另外，钌红可能在抑制TRPV1的同时，对于细胞其他位点也有作用，其作用性质尚不清楚。钌红试剂本身的质量也有待考究。

（3）CAP对于胃酸分泌作用不定：根据以往实验研究表明，CAP对于胃酸分泌的影响与其给药浓度、途径、时间均有关。[4]低剂量范围内CAP，胃酸分泌的抑制作用随CAP剂量增多而增强。在高剂量或去除神经系统调控因素下，胃酸分泌呈促进作用；本实验中，辣椒素与细胞作用时间、途径各组基本保持一致，因而基本无干扰；CAP作用于离体胃壁细胞，相关的神经因素影响较低，但不能确保CAP作用于细胞相同位点，以及辣椒素的浓度对于胃酸分泌也存在影响。

（4）CAP对于胃酸分泌的可能作用机制：CAP对于胃酸分泌的调节在离体细胞情况下，主要是通过作用于细胞的TRPV1受体，其过程可能与相关离子内流，激活细胞功能有关，或引起神经元及其纤维释放神经递质、肽类物质从而调节胃酸分泌。[5]

（5）实验存在的不足：取胃过程中，胃受到损伤，或消化液漏出，导致消化不彻底，获得细胞量较少。壁细胞荧光显微镜下的观察与鉴定存在问题，浓度可能尚未70%以上，导致成纤维细胞、主细胞等其他细胞对酶活性产生干扰。实验材料中，钌红作用缺乏显著性的原因可能是保存时未能保持良好避光，降低了钌红的生物活性。实验流程中，测量组先将样本液加入试剂盒中再水浴，对照组相反。由于该反应需在37℃条件下完成，且37℃水浴环境不会使氢钾ATP酶失活，故理论上，测量组的酶活性应强于对照组。部分实验结果与之不符，分析为磷污染或实验操作不当，故舍去。产生原因：可能出现磷污染，造成对照管的比色值较高；向测量管和对照管加入细胞样品时未充分混匀细胞液，导致细胞数目不等。

5 实验结论

对于离体壁细胞，TRPV1激活对于其胃酸分泌作用不固定。

参考文献

[1] Okumi H，Tashima K，Matsumoto K，et all. Dietary agonists of TRPV1 inhibit gastric acid secretion in mice. Planta Med，2012.78（17）：1801-6.

[2] Ericson A，Nur EM，Petersson F，et all. The effects of capsaicin on gastrin secretion in isolated human antral glands： before and after ingestion of red chilli. Dig Dis Sci，2009.54（3）：491-8.

[3] 史孝敏，李澤培，彭燕.TRPV1在消化系统疾病中的研究进展[J].胃肠病学，2013.18（07）：444-446.

[4] 谭婷婷，张琴，彭燕.辣椒素对胃酸分泌的影响及机制[J].世界华人消化杂志，2009.17（36）：3699-3703.

[5] 李魁君，李春刚，刘兴君.辣椒素受体（TRPV1）的生物学作用及其作为药物靶点的研究进展[J].沈阳药科大学学报，2011.28（11）：917-927.